SOX1与β-catenin通路的相关关系及其对早期胃癌内镜黏膜下剥离术后复发的预测价值

王菁华， 彭志红， 周 倩， 田 音

陆军军医大学第一附属医院(重庆西南医院)消化内科，重庆 400038

早期胃癌是指局限于黏膜或黏膜下层的胃癌，随着近年来内镜诊疗技术的发展，早期胃癌的诊断率有所提高，内镜下手术也被越来越多地用于早期胃癌的治疗。内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)是在内镜下黏膜切除术(endoscopic mucosal resection，EMR)基础上发展而来的内镜下手术方式，能够将病变黏膜及黏膜下层完整剥离并取得更为理想的整体切除率及组织学完整切除率，因而也被日本的研究作为内镜下治疗早期胃癌的标准方式[1-3]。国内近年来也开展了ESD，白顺滟等[4]研究报道了3.2%的早期胃癌患者ESD术后发生复发，针对早期胃癌患者ESD术后的复发进行早期评价、筛选可能发生复发的高危人群并进行严密随访具有积极的临床意义。

性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1，SOX1)是近年来新发现的一类抑癌基因，属于高迁移率族蛋白DNA结构域转录因子家族，对多种基因的表达具有调控作用[5]。胡爱萍等[6]在胃癌GES-1细胞中的实验证实，过表达SOX1能够通过下调β-catenin的表达抑制GES-1细胞的增殖、迁移、侵袭，表明SOX1靶向β-catenin通路在胃癌的发生、发展中起到抑癌作用。但SOX1在早期胃癌中表达的变化及意义均未阐明。因此，本研究将以接受ESD的早期胃癌患者作为对象，分析早期胃癌组织中SOX1与β-catenin的相关关系及其对ESD术后复发的预测价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2015年1月至2018年6月在我院接受ESD治疗的早期胃癌患者，入组标准：(1)符合早期胃癌的诊断，T1～2N0M0；(2)符合ESD指征[7]；(3)临床样本按要求收集并保存；(4)病历资料及术后随访资料完整。排除标准：(1)术前接受过放化疗；(2)术后接受放化疗；(3)既往有其他恶性肿瘤病史。共纳入402例患者，男211例，女191例，年龄(52.14±9.97)岁(35～67岁)。另选取同期在我院接受胃镜下胃黏膜活检并经病理证实为正常胃黏膜的受试者作为对照组，共108名，男64名，女44名，年龄(49.91±9.77)岁(35～62岁)。早期胃癌患者和正常胃黏膜受试者一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂与仪器SP二步法免疫组化试剂盒(货号KIT-9710)购自福州迈新生物公司，RIPA裂解液(货号P0013C)及BCA蛋白定量试剂盒(货号P0011)购自上海碧云天公司，SOX1(货号EPR4766)、β-catenin(货号ab16051)的抗体购自Abcam公司，正置显微镜购自Nikon公司，凝胶成像系统购自上海勤翔公司。

1.3 方法

1.3.1 临床样本的收集及保存：ESD术后收集早期胃癌组织适量，胃黏膜活检时收集正常胃黏膜组织适量，生理盐水清洗后，早期胃癌组织与正常胃黏膜组织均分为两份，一份用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋、蜡块室温保存，另一份在液氮中冷冻、取出后-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 免疫组化检测：取石蜡包埋的组织样本，制作病理切片后按照SP二步法免疫组化试剂盒的说明书进行操作，对SOX1、β-catenin进行染色，在显微镜下随机观察5个高倍视野(400×)并计数100个细胞，按照阳性染色细胞比例及染色强度进行评分，方法如下：阳性染色细胞≤5%为0分、>5%且≤25%为1分、>25%且≤50%为2分、>50%且≤75%为3分、>75%为4分，染色强度不染色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分，两项评分相乘≥4分为阳性。

1.3.3 Western blotting检测：取液氮冷冻的组织样本，加入RIPA裂解液后充分裂解组织、提取蛋白并测定蛋白含量，取含有30 μg蛋白的样本，加入SDS-PAGE中进行电泳，电转移至PVDF膜后在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，在1∶1 000稀释的SOX1、β-catenin抗体或1∶5 000稀释的β-actin抗体中4 ℃孵育过夜；次日，洗膜3遍并在1∶1 000稀释的HRP二抗中室温孵育1 h，最后在凝胶成像系统中显影得到SOX1、β-catenin、β-actin的条带，扫描条带灰度值并以β-actin为内参计算SOX1、β-catenin的蛋白表达量。

1.3.4 随访：ESD术后3个月内,每个月复查1次;术后3～12个月,每3个月复查1次;1年后,每6个月复查1次，复查项目包括血常规、生化、胃镜等。随访截止日期为2019年12月31日，随访并记录患者的复发情况。

2 结果

2.1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中SOX1、β-catenin表达的比较与正常胃黏膜组织比较，早期胃癌组织中SOX1阳性率、SOX1蛋白表达量明显降低,β-catenin阳性率、β-catenin蛋白表达量明显增加(P<0.05)(见图1～2、表1)。

2.2 早期胃癌组织中SOX1与β-catenin表达的相关性经Spearman检验，早期胃癌组织中SOX1的阳性率与β-catenin的阳性率呈负相关(r=-0.394，P=0.013)；经Pearson检验，早期胃癌组织中SOX1的蛋白表达量与β-catenin的蛋白表达量呈负相关(r=-0.438，P=0.008)。

图1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中SOX1、β-catenin的免疫组化图(放大400倍)

2.3 不同临床病理特征早期胃癌组织中SOX1、β-catenin表达的比较不同性别、年龄患者的早期胃癌组织中SOX1阳性率、β-catenin阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与中-高分化、黏膜内早期胃癌组织比较，低-未分化、黏膜下早期胃癌组织中SOX1阳性率明显降低(P<0.05);T1期与T2期早期胃癌组织中SOX1阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与黏膜内早期胃癌组织比较，黏膜下早期胃癌组织中β-catenin阳性率明显增加(P<0.05)，T1期与T2期、中-高分化与低-未分化早期胃癌组织中β-catenin阳性率的比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

图2 早期胃癌组织与正常胃黏膜组织中SOX1、β-catenin的蛋白条带图

表1 早期胃癌组织与正常胃黏膜组织中SOX1、β-catenin表达的比较

表2 不同临床病理特征早期胃癌组织中SOX1、β-catenin阳性率的比较[例数(%)]Tab 2 Comparison of SOX1 and β-catenin positive rates in early gastric cancer tissues with different clinicopathological features [n(%)]

2.4 SOX1、β-catenin阳性及阴性表达患者肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线分析绘制早期胃癌患者ESD术后复发的Kaplan-Meier曲线并分析，与SOX1阴性表达患者比较，SOX1阳性表达患者的复发率明显降低(P<0.05)(见图3)；与β-catenin阴性表达患者比较，β-catenin阳性表达患者的复发率明显升高(P<0.05)(见图4)。

图3 SOX1阳性及阴性表达患者肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线;图4 β-catenin阳性及阴性表达患者肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线

2.5 早期胃癌患者肿瘤复发相关因素的Cox回归模型分析以早期胃癌患者术后复发为应变量，以性别、年龄、T分期、分化程度、浸润深度、SOX1及β-catenin表达为自变量，进行Cox回归分析可知：黏膜下浸润、SOX1阴性表达是早期胃癌患者术后复发的危险因素(见表3)。

表3 早期胃癌患者术后复发影响因素的Cox回归分析

3 讨论

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，早期胃癌是指局限于黏膜或黏膜下层、伴或不伴淋巴结转移的胃癌，经有效治疗后的5年生存率为90%以上。近年来，ESD被越来越多地用于早期胃癌的治疗，日本的研究认为，ESD适用于淋巴结转移可能性极小的早期胃癌并将ESD作为早期胃癌内镜治疗的标准方法[3]。ESD的优势在于能够一次性完整切除直径>2 cm的黏膜病变且切除深度包括黏膜全层、黏膜肌层及大部分黏膜下层，可以取得较为理想的组织学治愈性切除率并降低局部复发率。尽管如此，仍有一定比例的早期胃癌患者会发生ESD术后复发，需要寻找能够早期预测肿瘤复发的标志物。

SOX1是近年来发现的一类抑癌基因，在食管癌、宫颈癌、子宫内膜癌中均呈异常表达[8-10]，但该基因在胃癌发生、发展中的作用尚不明确。本研究选择了未发生淋巴结转移的早期胃癌患者进行研究，与正常胃黏膜组织比较，早期胃癌组织中SOX1的表达明显减少且肿瘤分化程度越低、浸润越深，SOX1的表达越少，表明SOX1的低表达与早期胃癌的发生、发展有关。进一步随访402例早期胃癌患者的术后复发情况，共18例发生复发，复发率为4.47%，与白顺滟等[4]报道的早期胃癌ESD术后复发率3.2%基本一致，与未复发患者比较，复发患者早期胃癌组织中SOX1的表达明显减少且经Kaplan-Meier曲线分析，与SOX1阴性表达患者比较，SOX1阳性表达患者的复发率明显降低，表明SOX1的低表达与早期胃癌的术后复发有关，符合SOX1抑癌基因的特性。

胃癌相关的细胞实验表明，SOX1对胃癌GES-1细胞的增殖、迁移、侵袭均具有抑制作用且该作用与抑制β-catenin表达有关[6]。β-catenin是Wnt信号通路的核心分子，通过调节下游Cyclin D1、N-cadherin、MMP9等基因的表达来促进细胞增殖、迁移、侵袭，在多种恶性肿瘤的发生、发展中起到促癌作用[11-13]。口腔鳞癌及甲状腺癌中的细胞实验证实，SOX1能够抑制细胞中Wnt通路的激活，与SOX1抑制胃癌细胞中β-catenin表达的作用一致，表明SOX1通过靶向β-catenin发挥抑癌作用[14-15]。本研究对早期胃癌中β-catenin的分析表明，早期胃癌组织中β-catenin的表达高于正常胃黏膜组织且与SOX1的表达呈负相关，表明β-catenin的高表达参与了早期胃癌的发生且低表达的SOX1可能通过增加β-catenin的表达在早期胃癌的发生、发展中起促癌作用，但SOX1靶向β-catenin影响胃癌生长的效应仍需今后进一步的动物实验来验证。

恶性肿瘤病理特征的恶化与疾病预后、肿瘤复发、总生存期均有关，早期胃癌复发也与其病理特征有关[16-18]，国内刘黎等[19]的研究报道了早期胃癌术后复发与浸润深度有关。本实验通过Cox模型分析了早期胃癌患者ESD术后复发的相关因素并发现，黏膜下浸润及SOX1阴性表达是早期胃癌ESD术后复发的危险因素。其中，黏膜下浸润与早期胃癌ESD术后复发相关的结果与刘黎的研究结果一致，而SOX1阴性表达与早期胃癌ESD术后复发相关的结果与SOX1的抑癌特性吻合。但在本实验的Cox模型中，未发现β-catenin阳性表达与早期胃癌ESD术后复发的相关性，可能因为SOX1通过β-catenin以外的其他机制发挥抑癌作用，虽然β-catenin的高表达与早期胃癌的发生、病理特征恶化及SOX1的低表达有关,但β-catenin并不直接参与早期胃癌远期病情的转归，在今后的研究中仍需进一步探究SOX1影响早期胃癌复发的下游机制。

综上所述，早期胃癌中SOX1的表达减少、β-catenin表达增加，SOX1的阴性表达与β-catenin通路激活、病理特征恶化有关，SOX1阴性表达是早期胃癌患者ESD术后复发的危险因素,对术后复发具有预测价值。