枸杞多糖对小鼠造血系统放射损伤的保护作用※

杨 美，王 冰，孙祥益，张 雨，陈 凡，冯瑞兴，王 财，殷 麟

(1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院，青海 西宁 810001)

造血系统对射线高度敏感。射线照射机体后，抑制了骨髓细胞的增殖及分裂，损害了其功能，致血细胞的来源减少[1]。放射治疗还会造成免疫系统失调，引发一系列炎症[2]。因此，寻找有效保护药物减轻放疗损伤意义非常。

本研究建立小鼠放射损伤动物模型(5Gy射线照射)。通过对模型小鼠外周血象的检测，脏器指数的计算，DNA含量以及TNF-α，IL-2水平的测定来探讨枸杞多糖对小鼠放射损伤的保护作用。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

枸杞多糖(批号：TKSW191113-1，含量80%)购自陕西泰克生物有限公司。

1.1.2 主要试剂

小鼠白介素2酶联免疫检测试剂盒(IL-2，货号：JL20256)、小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫检测试剂盒(TNF-α，货号：JL10484)购自于江莱生物科技有限公司。无水氯化钙产品购自天津市永大化学试剂公司。伊红(货号：G1100)、苏木素(货号：G1080)购自于北京索莱宝科技公司。

1.1.3 主要仪器

医用电子直线加速器购自美国VaRian公司(23EX)。Sysmex XN-2000(A1)全自动模块式血液体液分析仪购自日本希森美康株式会社。iMark酶标仪购自美国BioRad仪器有限公司。DNP-9022恒温培养箱购自上海精宏设备司。DW-HL528超低温冰箱购自中科美菱低温科技公司。BT224S电子分析天平购自德国赛多利斯科学仪器公司。显微镜购自宁波舜宇仪器有限公司(RX50)。TU-1810型紫外分光光度计购自北京普析通用仪器公司。

1.1.4 动物

8周龄健康昆明种雄性小鼠50只[动物合格证号：SCXK(陕)2017-003]，体重(22±2)g，购于西安交通大学医学中心。每笼随机群养10只，行7 d适应性喂养后(日光光照昼夜交替，自由饮水饮食)开始实验。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组方法

将50只小鼠随机均分为5组：正常对照组、单纯照射组、照射+枸杞多糖低剂量组(50mg/kg)、照射+枸杞多糖中剂量组(100mg/kg)、照射+枸杞多糖高剂量组(200mg/kg)。

1.2.2 给药方法

正常对照组及单纯照射组每天以灌胃途径给予生理盐水(0.5mL/d)，药物组(药物剂量为20mL/kg)每天以灌胃途径给予等体积药物。将单纯照射组、药物组小鼠连续灌胃7 d后予以照射，照射后继续灌胃7 d。

1.2.3 照射方法

将小鼠固定在模具中，用医用电子直线加速器行全身一次性照射(视野为40×40cm，源皮距为100cm，剂量为5Gy，照射时间为100s，吸收剂量率设置为300cGy/min)。

1.2.4 外周血象检测方法

照射后第7 d，于含有EDTA-2Na的抗凝管中取小鼠右眼球血制备全血，而后取全血20 μL稀释后再使用血细胞分析仪行血象水平检测。

1.2.5 脏器指数测定方法

照射第7 d对小鼠进行称重后将脾脏、胸腺取出称重(使用精密天平)。脏器指数(%)计算公式：[脏器重量(g)/动物体量(g)]×100%。

1.2.6 骨髓DNA含量测定方法

照射完成后于第7 d处死各组小鼠，取其右侧股骨，剪断第二股骨，反复用提前配制好的10 mL CaCl2(0.005mol/L)溶液将全部骨髓冲入提前准备好的离心管中。把离心管内的骨髓液在冰箱(4℃)中静置30 min后离心(2500r/min)15 min，去上清液，将5 mL HClO4(0.2mol/L)加入沉淀物中进行底物酸化，将经酸化后的沉淀物轻轻震荡混匀，而后用90 ℃水浴锅持续加热15 min，经流水冷却，用滤纸过滤获取纯净滤液。用紫外分光光度计检测纯净滤液在260 nm处的吸光度值(A)，以此确定DNA含量。

1.2.7 脾脏TNF-α、IL-2检测方法

用电子天平称取1 g组织标本。将9 mL的PBS液(pH介于7.2～7.4)倾倒至标本中用匀浆器匀浆后离心(2500r/min)20 min左右，弃沉淀取上清液。然后严格依照酶联免疫检测试剂盒说明书操作，测定小鼠脾脏TNF-α、IL-2水平。

1.2.8 骨髓病理切片制备方法

小鼠被处死后，取其左侧股骨用生理盐水冲洗干净，用4%多聚甲醛固定，置不同浓度酒精中脱水后以常规方法制片(用苏木精、伊红染色)。

1.3 统计学方法

2.实验结果

2.1 照射的影响

正常对照组小鼠进食饮水量、活动度未发现明显变化，而单纯照射组和药物干预组出现不同程度的摄食(水)减弱和活动不积极现象。照射后，单纯照射组和枸杞多糖各剂量组小鼠体重均表现出不同程度降低，以单纯照射组体重降低较为显著。照射后第1 d，单纯照射组和枸杞多糖各剂量干预组体重都轻微下降，枸杞多糖低剂量组小鼠体重下降明显(P<0.05)。照射后第3 d和第5 d各组小鼠体重变化无统计学差异。照射后第7 d，枸杞多糖各剂量干预组同单纯照射组比，体重上升，其中枸杞多糖高剂量组体重变化具有统计学意义(P<0.05)；单纯照射组同正常对照组比，体重下降明显(P<0.01)。详见表1。

表1 各组小鼠不同时间体重变化情况

2.2 枸杞多糖对小鼠血象的影响

同正常对照组比，单纯照射组小鼠WBC、HGB、PLT数目减少(P<0.01)，而RBC无统计学意义，显示造模成功。同单纯照射组比，枸杞多糖低剂量组的WBC显著性升高(P<0.01)，枸杞多糖低剂量组的RBC、HGB显著降低(P<0.01)，枸杞多糖高剂量组的RBC、HGB显著降低(P<0.05)。药物干预组PLT同单纯照射组相比有所上升，但无统计学差异(P>0.05)。详见表2。

表2 枸杞多糖对小鼠血象的影响结果

2.3 枸杞多糖对小鼠胸腺指数、脾脏指数及DNA含量的影响

单纯照射组与正常对照组比，胸腺指数、脾脏指数和DNA的含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。枸杞多糖高剂量组同单纯照射组比，脾脏指数及DNA的含量升高(P<0.05，P<0.01)。详见表3。

表3 枸杞多糖对照射小鼠脏器指数的影响

2.4 枸杞多糖对小鼠TNF-α、IL-2的影响

单纯照射组同正常对照组比，TNF-α含量显著增加(P<0.01)，IL-2水平明显降低(P<0.01)。与单纯照射组比，TNF-α含量在枸杞多糖低、中、高剂量组中均有所下降(P<0.01)，而IL-2水平在枸杞多糖低、中、高剂量组中均上升(P<0.01)。详见表4。

表4 枸杞多糖对放射损伤小鼠脾脏IL-2、TNF-α水平的影响

2.5 枸杞多糖对小鼠骨髓切片的影响

图1显示，正常对照组的镜下有核细胞呈蓝色，骨髓有核细胞较多，空泡少，骨髓造血能力强；单纯照射组与正常对照组比，前者空泡增多，射线可致骨髓中有核细胞数目减少，提示骨髓造血能力受到损害。枸杞多糖各剂量组：随着药物浓度的增加，骨髓有核细胞逐渐增加，空泡减少，提示造血能力逐渐增强。同单纯照射组比，不同剂量枸杞多糖的使用可让骨髓损伤程度有所减轻。

图1 各组小鼠骨髓细胞病理变化图(HE，×400)

3.讨论

造血系统对全身照射敏感[3]，外周血象被认为是辐射损伤后显示机体功能异常的敏感指标[4]。本研究以外周血象为指标，观察射线对小鼠的损伤程度以及枸杞多糖对损伤的保护效果。小鼠的外周血象在单纯照射组中的计数下降，而枸杞多糖一定程度上抑制了这种下降，提示枸杞多糖在对小鼠造血系统辐射损伤保护中起着一定积极作用。

胸腺和脾脏对辐射较为敏感，因此可用它们显示辐射对机体免疫力的改变程度。本研究结果显示，单纯照射组脾脏和胸腺指数明显降低。具体来说，它们的体积和重量都比正常对照组低，各项指标也比正常对照组有所下降。枸杞多糖的使用虽然导致脾脏指数有一定增加，但同正常对照组比，仍有一定差异：辐射会导致长期的免疫系统减弱或者抑制。射线也可致大分子结构破坏和DNA中的单链或双链断裂，影响细胞周期，从而阻碍DNA合成，促进基因突变和凋亡[5]。本实验中，枸杞多糖低、中、高剂量组的DNA含量比单纯照射组高，尤以枸杞多糖高剂量组最显著。

IL-2来源于辅助性T细胞，具有多向性作用。它不仅能使T细胞活化，促进细胞因子的产生，增强机体细胞免疫；还可刺激NK细胞增殖，加强NK细胞的杀伤活性，促进B细胞的增殖及分泌抗体，激活巨噬细胞，增强体液免疫。本研究结果显示，射线照射后的IL-2水平及胸腺指数降低，显示免疫系统的自我调节能力减弱。枸杞多糖提高了IL-2水平，增强了机体免疫的反应能力。活化的单核-巨噬细胞及其他多种细胞均可产生TNF-α，其具有促炎性及多向性[6]。机体内作为细胞因子调节网络的关键启动因子TNF-α，可促使其他细胞因子的合成及释放，产生细胞因子瀑布效应，趋化炎症介质，进而放大了炎症效应[7]。本研究中，单纯照射组同正常对照组比，TNF-α水平升高明显，这与之前的报道一致[8]。枸杞多糖各剂量组与单纯照射组比，TNF-α水平显著下降，提示枸杞多糖对TNF-α水平调节起良性作用。

对射线高度敏感的骨髓，受到照射后可使骨髓造血细胞形态和功能发生改变。骨髓有核细胞的数量和形态变化程度显示骨髓造血能力强弱。骨髓有核细胞数出现不同程度的降低提示骨髓造血功能受到抑制[9]。实验结果显示，枸杞多糖组相比单纯照射组，骨髓组织中有核细胞数量有一定增加，提示造血能力增强，这与骨髓DNA含量变化一致。

综上所述，枸杞多糖对小鼠造血系统的放射损伤有一定保护作用。