应用相容溶质四氢嘧啶制备保湿霜及其保湿效果评价*

乔丽娟，马雪丽，王 泽，裴婵明，沈国平，邢江娃，朱德锐，王 嵘

(青海大学医学院，基础医学研究中心，青海 西宁 810001)

高原环境干燥、紫外线强，研制保湿霜对维护皮肤健康意义非常。皮肤保湿效果主要取决于角质层的含水量，角质层含水量处于10%～30%之间时皮肤呈现健康状态。

四氢嘧啶(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine)是嗜盐或耐盐菌胞内合成的一类能够抵抗外界高盐胁迫的相容溶质，能够对细胞、蛋白质和核酸提供保护作用，可作为细胞保护剂和稳定剂。Ectoine能够聚集H2O分子簇，具有重组皮肤细胞膜、保护皮肤免受紫外线伤害、抑制黑色素生成的作用。同时，Ectoine还可保护细胞膜屏障免受表面活性剂的破坏；聚集的Ectoine-H2O分子簇能在一段时间内保持相对稳定，产生长效保湿功效，功效优于甘油[1-2]。

本研究应用相容溶质四氢嘧啶制备保湿霜，并初步评价其保湿及美白效果。

1.材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

实验级豚鼠[动物批准号SCXK(陕)2019-003，购自陕西科奥生物有限公司]，动物的使用与处理经青海大学医学院实验动物伦理委员会批准。Ectoine(HPLC级，≥98%，购自上海泰坦科技有限公司)；电热鼓风干燥箱(DHP-9162型，上海恒科公司)；移液器和离心机(德国Eppendorf公司)；高压蒸汽灭菌锅(CL-40M，日本ALP公司)；分析天平(JB/T-5374-1991，精度0.1mg，瑞士梅特勒-托利多公司)；纯水仪(Mili-Q Integral，美国默克化工公司)；高速匀质机(IKA-T18型，德国IKA公司)；无菌操作台(VD-850型，苏州净化公司)；V1000紫外可见分光光度计(SP-754型，上海天美公司)；精密pH计(SK-IV型，香港百士香公司)；皮肤水分测试仪(M17B型，深圳市美立康科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 保湿霜制备

A相的制备：称取适量的去离子水、甘油、金缕梅提取液置匀质机搅拌至均匀。B相的制备：称取适量的鲸蜡硬脂基葡糖苷、甘油油酸酯柠檬酸酯、乳木果油于80 ℃超级恒温水浴箱中搅拌至溶解。将B相沿玻璃棒缓慢加至A相并沿着一个方向搅拌至混匀。待温度冷却至45 ℃时，加入剩余成分后置高速匀质机乳化20 min。

1.2.2 乳化体系与工艺条件

为了确定最佳乳化体系的成分配比，在单因素试验的基础上进行正交实验。选择对乳化体系稳定性影响较大的甘油油酸酯柠檬酸酯、鲸蜡硬脂基葡糖苷、乳木果油、甘油4种成分；同时选择对制备工艺起重要性影响的乳化温度、乳化时间、搅拌速率和投料方式4种条件因素，分别进行4因素3水平正交实验(表1～2)。采用正交设计表L9(34)对乳化剂的配比和制备工艺条件进行甄选，并对最佳的配方体系进行外观、气味、色泽和涂展性考察，评估值各25分，以确定最佳乳化剂组成配比及工艺条件。

表1 L9(34)乳化剂配比正交实验因素水平表

表2 L9(34)制备工艺条件正交实验因素水平表

1.2.3 感官及理化评价

感官及理化指标评价参考《中华人民共和国轻工行业标准QB/T2872-2017》进行。皮肤毒性试验与刺激性试验[3]：准备20只豚鼠，将豚鼠背部两侧脱毛处理后(4cm×5cm)，采用同体自身左右对比法将脱毛皮肤划破(以渗血为度)、消毒，左右两侧皮肤的破损程度相一致，左侧涂受试样品，右侧涂赋形剂作为空白对照组，15 min后用温水清洗，分别于1、24、48、72 h和96 h时观察涂抹皮肤的变化(评价标准及评分：无反应0，轻度1，中度2，重度3；评价指标：红斑，充血，水肿，出血，糜烂，溃疡)。人体斑贴试验评价采用《试用人群调查表》[4]：选取健康志愿者20人，男女各50%，年龄22～25岁。用受试物原液或稀释液沾湿纱布(折叠数层，每边1cm)后紧贴于前臂内侧皮肤上，外盖一层油纸或塑料薄膜，用绷带固定。分别于24、48 h时观察涂抹部位的皮肤变化情况。受试部位无任何反应为(-)；出现轻微瘙痒发红为(+)；出现单纯红斑、瘙痒为(±)；出现水肿性红斑、丘疹为(++)；出现显著红斑、丘疹及水疱为(+++)。

1.2.4 功效性评价

体外功效测定：保湿率测定参照文献方法[5]用载玻片和医用透气胶带(类仿角质层和表皮)制成2 cm×3 cm的模拟装置，涂抹0.5 g的样品，放入25 ℃的电热鼓风干燥箱中。精密称量模拟装置样品放置前质量(M1)和放置后质量(M2)，称量间隔5 min，共4次，计算保湿率(M2/M1×100%)。美白性能测定采用酪氨酸酶抑制活性法检测[6]，在475 nm处检测吸光度值，并计算样品液的酪氨酸酶抑制率(Ⅰ)，Ⅰ%=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]×100%(其中A1为空白样板有酶体系吸光度、A2为空白样板无酶体系吸光度、B1为样品组有酶体系吸光度、B2为样品组无酶体系吸光度)。人体功效评价：分别测试试用者使用前以及使用后(即时、30min、60min)的皮肤水分值，以水分值的差值大小评测产品保湿性(温度20℃，相对湿度40%～60%)。使用产品前后皮肤水分值差别反映产品的即时补水能力，60 min后的皮肤水分值反映保湿霜的持续缩水能力。肤质改善测试：仅测试使用产品前后皮肤的含水量、含油量[7-8]。

1.3 统计学方法

2.结果

2.1 乳化剂配比的正交实验

以外观、气味、色泽和涂展性为综合考察指标，设计正交实验L9(34)，进行乳化剂配比和极差分析(表3)。结果显示极差数据RB>RC>RD>RA(因素B>C>D>A)，即鲸蜡硬脂基葡糖苷影响最大，其次是乳木果油和甘油。甘油油酸酯柠檬酸酯的影响最小，差异性不明显。最佳浓度配比组合为A1B3C1D2，即甘油油酸酯柠檬酸酯为0.83%、鲸蜡硬脂基葡糖苷为8.0%、乳木果油为2.7%和甘油为5.0%。基于此配比组合所制备的保湿霜稳定性最佳。

表3 乳化剂配比正交实验结果分析

2.2 制备工艺条件设定

以外观、气味、色泽和涂展性为综合考察指标，设计正交实验L9(34)，进行制备工艺条件选择和极差分析(表4)。结果显示极差数据RD>RC>RA>RB(因素D>C>A>B)，即加料方式影响最大，其次是乳化温度和搅拌速度。乳化时间的影响最小，差异性不明显。最佳工艺条件组合为A2B2C2D3，即搅拌速率为10000 r/min，乳化温度为80 ℃、乳化时间为20 min。最佳制备方法为油水分相法。

表4 制备工艺的正交实验结果分析

2.3 配方方案设定

经正交实验甄选最佳乳化剂浓度配比与制备工艺，确定最佳配方体系(表5)。

表5 四氢嘧啶纯天然保湿霜配方

2.4 理化及稳定性评价

按照上述配方制备保湿霜，皮肤涂抹实验显示分布均匀，pH介于5.0～6.0之间，呈弱酸性。离心(3000r/min)30 min后，未出现油水分层现象；在高温40 ℃和低温-10 ℃条件下均未出现分层、析出颗粒或其他不均一的现象；在自然光照条件下连续放置一周后未出现变色、变味或其他异常现象。

2.5 功效性评价

设置Ectoine质量分数梯度为0%、0.5%、1%、1.5%和2%，对Ectoine浓度配比进行甄选，并计算保湿率(表6)。本研究配方中，Ectoine的最佳比例为1.5%，保湿效果最佳(保湿率均值99.6%)。Ectoine浓度与保湿效果分析显示，浓度低于1.5%时，保湿效果有所下降(86.9%～97.9%)，而高于1.5%后的保湿效果无显著差异(97.9%～99.6%)。按配方制备的保湿霜的保湿效果：在25 ℃时4个时间段(5、10、15、20min)的保湿率分别为99.9%、99.7%、99.5%、99.3%，平均保湿率达99.6%；酪氨酸酶抑制率达62.0%。使用前、后以及使用后30 min及60 min皮肤水分值试验、组间方差分析结果(表7～8)显示，使用前后皮肤水分率变化明显(使用前33.25%，使用后47.67%)，平均增长率为14.42%，使用后(即时，30min，60min)相对于使用前皮肤水分率明显提升，组间差异显著(P<0.05)，说明该保湿霜的补水能力强。使用后30、60 min的水分率分别为44.0%、43.55%，水分率无明显变化，说明该保湿霜持续补水能力较强，保湿性能良好。

表6 不同质量分数四氢嘧啶保湿霜的保湿率

表7 皮肤水分率测试及斑贴试验结果

续表：

表8 皮肤水分率的分析统计结果

3.讨论

乳化剂是化妆品配方中的重要组分，不仅要具备优异的乳化性能(可使油和水形成均匀、稳定的乳化体系)，而且要有有利于各组分发挥其护理性能及功效性的作用[9]。常见的乳化剂类型主要包括脂肪醇聚氧乙烯醚系列、烷基糖苷系列、司盘吐温系列、多元醇酯型、阳离子表面活性剂以及高分子乳化剂等[10]。然而，上述这些乳化剂大多数为化学源或化学合成所得，并非纯天然来源。目前，随着消费者追求天然、环保和安全的品质需求，大量的两性蛋白质、多糖、生物表面活性剂、磷脂等天然乳化剂替代合成表面活性剂，或采用植物蛋白代替动物蛋白[13]。本研究中，保湿霜的最佳乳化体系配比为鲸蜡硬脂基葡糖苷8.0%，甘油油酸酯柠檬酸酯0.83%，乳木果油2.7%和甘油5.0%。其中，主要乳化剂成分鲸蜡硬脂基葡糖苷属于烷基糖苷类乳化剂，由天然植物来源的脂肪醇和葡萄糖合成，具有卓越的化学稳定性和抗水解性能，与皮肤相容性良好。同时，乳化剂成分甘油油酸酯柠檬酸酯源自棕榈油或椰子油，与人体皮肤兼容性良好，添加至乳品中可改进其延伸性，具有润滑和柔软肌肤的效果。

研究表明天然乳化剂与其他乳化剂配伍使用，可以提高天然乳化剂形成和稳定乳液的能力[11]。本研究选取两种天然乳化剂(鲸蜡硬脂基葡糖苷和甘油油酸酯柠檬酸酯)，采用亲水-亲油平衡值(HLB值)复配后[12]，配伍添加甘油和乳木果油，制备的乳化体系无刺激性，稳定性良好。其次，乳木果油与乳化剂的配伍可以提高乳木果油的渗透性，使有效成分易于吸收，具有修复和保护皮肤的功能[13-14]。按上述乳化体系制备的保湿霜具有纯天然性，不含聚乙二醇(PEG)，安全，可生物降解，肤感水润，尤其适用于敏感性肌肤。

乳化指将两种互不相溶的液体，在强烈的搅拌下使二者分散均匀，并形成稳定的乳状液。在化妆品研发过程中，乳化温度、乳化时间以及搅拌速度都是必须重点考虑的问题。李珊珊等[15]制备蜂王浆护肤品时选择，乳化温度为90 ℃、搅拌速度为4500 r/min时乳化效果最佳。梁红冬等[16]制备一种含香蕉皮提取物的保湿护手品时设定搅拌速率为600 r/min、乳化温度为75 ℃时乳化效果最佳。本研究选择搅拌速率为10000 r/min、乳化温度为80 ℃。

综上所述，本研究研制的Ectoine保湿霜制备工艺可靠、适用，保湿及美白效果良好。