FOXP1突变与青海地区藏族先天性心脏病的相关性※

李爽林，马 强，张 辉，杨应忠，刘永年*

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海大学研究生院，青海 西宁 810016)

目前认为[1]，先天性心脏病是由遗传因素和环境因素二者共同作用而成的。青海地处高原，先天性心脏病发病率较低海拔地区高[2]，且世居藏族儿童比移居汉族儿童高[3]。因此，研究青海地区藏族先天性心脏病患者的易感因素具有重要意义。有研究发现，缺失FOXP1基因的小鼠出现心肌细胞发育成熟障碍[4]；使用胎儿cDNA行定量实时聚合酶链反应发现，FOXP1在人类胎儿心脏中的表达水平高于其他胎儿组织[5]。FOXP1突变可引起NKX2.5异常激活[6]，NKX2.5是心脏重要的转录因子，其突变可引起功能性的心脏缺陷[7]，推测FOXP1与先天性心脏病相关。课题组前期通过Genome-Wide HumanSNP Array6.0芯片检测技术对67例先天性心脏病患者与64例正常对照的908440个SNP位点进行基因检测，SNP芯片基因分型结果发现非编码区rs17008125位点所在的FOXP1基因与先天性心脏病相关。本课题就FOXP1突变与青海地区藏族先天性心脏病的相关性做相关研究。

1.对象与方法

1.1 研究对象和标准选择

病例组研究对象选择2018年9月至2020年1月在青海大学附属医院心血管科就医的青海地区藏族先天性心脏病患者100例，对照组选取同期同一家医院体检中心进行体检的地区、民族、性别、年龄相匹配的健康者100例。

病例组男性45例，女性55例；对照组男性52例，女性48例，卡方检验分析结果显示性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。病例组平均年龄为(16.77±9.9)岁，对照组为(19.87±9.5)岁，两组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 病例组和对照组一般情况

病例组确诊标准以中华医学会公布的《临床诊疗指南》标准为准。研究方案经青海大学医学院伦理委员会批准。

1.2 样本收集和DNA提取

使用EDTA钾抗凝管采静脉血5 mL离心(4000r/min)10 min后吸取血浆层至冻存管，置冰箱保存(-80℃)；在白细胞层中加入红细胞裂解液混匀后离心(4000r/min)去除红细胞，最后加入白细胞裂解液保存(室温)。

使用Gentra Puregene Blood Kit试剂盒(Qiagen，Germany)，按照标准步骤提取基因组DNA，提取后的DNA经琼脂糖凝胶(1.5%～2.0%)电泳40 min后，用核酸检测仪(NanoDrop 2000c，Thermo，USA)测定浓度并稀释至200 ng/μL后冻存于冰箱(-20℃)。

1.3 FOXP1外显子序列引物设计和PCR扩增

在NCBI网站的GeneBank数据库中查找FOXP1基因外显子序列，应用Primer3网站在线设计FOXP1基因外显子引物(表2)。

表2FOXP1基因外显子引物

利用PCR反应扩增FOXP1外显子目的片段。反应体系：加入DNA1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL及ddH2O至25 μL。PCR反应：①94 ℃预变性5 min；②94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环34次；③72 ℃下延伸5 min。扩增产物在琼脂糖凝胶(1.5%～2.0%)上行电泳(100V)40 min，通过凝胶成像仪观察分析PCR产物质量。扩增产物外送至上海美吉生物公司测序，应用FinchTV软件分析测序结果，筛选外显子的突变位点，分析FOXP1编码区基因多态性。

1.4 统计学处理

数据统计分析采用SPSS19.0软件，病例组及对照组间年龄比较采用t检验，两组间性别比较采用卡方检验，检验水准为α=0.05。

2.结果

2.1 DNA提取结果

基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成效系统照相显示DNA条带清晰整齐、明亮无杂带，表明提取的DNA浓度较高、污染少无降解(图1)。

图1 DNA样本电泳

2.2 FOXP1外显子序列PCR扩增产物检测结果

对样本DNA扩增FOXP1外显子片段，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，通过Marker标准核对外显子的PCR产物长度是否符合测序条件。以下为部分FOXP1外显子产物电泳图(图2)。

图2 FOXP1基因外显子2 PCR产物电泳图

图3 FOXP1基因外显子6 PCR产物电泳图

图4 FOXP1基因外显子15 PCR产物电泳图

2.3 FOXP1外显子序列测序结果

测序结果显示，FOXP1编码区序列外显子2第211位的碱基胞嘧啶(cytosine，C)突变为腺嘌呤(adenine，A)，即c.211C>A，基因型C/C杂合突变为基因型C/A，导致第71位密码子CAG编码的谷氨酰胺(Glutamine，Q)发生非同义突变，突变为AAG编码的赖氨酸(Lysine，K)即p.Q71K(图3A)，在NCBI的GeneBank数据库中未查到相应注册SNP位点，为新发现位点；外显子6第733位碱基腺嘌呤(adenine，A)突变为鸟嘌呤(guanine，G)，即c.733A>G，基因型A/A杂合突变为A/G，导致第245位密码子ACA编码的苏氨酸(threonine，T)发生非同义突变，突变为GCA编码的精氨酸(arginine，R)，即p.T245R(图3B)，在NCBI的GeneBank数据库中未查到相应注册SNP位点，为新发现位点；外显子6第852位碱基胞嘧啶(cytosine，C)突变为胸腺嘧啶(thymine，T)，即c.852C>T，基因型CC杂合突变为CT，导致第283位密码子CAC编码的组氨酸(Histidine，H)发生同义突变，突变为CAT编码的组氨酸(Histidine，H)，即p.H283H，在NCBI的GeneBank数据库中注册的SNP位点为rs201138716(图3C)；外显子15第1762位碱基鸟嘌呤(guanine，G)突变为腺嘌呤(adenine，A)，即c.1762G>A，基因型GG杂合突变为GA，导致第588位密码子GCT编码的丙氨酸(Alanine，A)发生非同义突变，突变为ACT编码的苏氨酸(Threonine，T)，即p.A588T，在NCBI的GeneBank数据库中注册的SNP位点为rs202173892(图3D)。

A：外显子2(c.211C>A)；B：外显子6(c.733A>G) C：外显子6(c.852C>T)；D：外显子15(c.1762G>A)

3.讨论

研究FOXP1多态性与先天性心脏病的相关性具有重要意义。心脏的发育过程非常复杂，由多个基因多种细胞协同参与调控，至今具体的发病机制仍不完全清楚，目前认为先天性心脏病的主要病因是遗传和环境两个危险因素，其中引起先天性心脏病的遗传因素[8]包括单基因突变、多基因突变、染色体变异等，因此，先天性心脏病分子遗传水平的筛查对先天性心脏病的早期防治具有十分重要的意义。随着千人基因组计划的完成和分子遗传学基因芯片和高通量测序等技术的不断发展，已发现了一部分先天性心脏病的相关致病基因[9]，包含GATA4、NKX2.5、TBX5等基因。研究显示[10]，约455个候选基因与先天性心脏病相关，这一数据还在不断更新。先天性心脏病分子遗传学新技术主要集中在单核苷酸多态性和基因测序等方面。先天性心脏病发病呈现出显著的地区性差异[11]，流行病学调查发现[12]，同一省份海拔高度有差异的地区患病率也有较大不同，青海海拔较高地区患病率高于青海低海拔地区[13]。提示先天性心脏病与高原低氧有一定关系，且有研究发现[3]，高原世居藏族患病率高于移居汉族。本研究通过检测FOXP1编码区外显子的基因多态性位点，探讨FOXP1基因突变与青海地区藏族先天性心脏病的相关关系。

FOXP1是位于染色体3p14.1上，长度为628 kb，包含16个外显子，编码678个氨基酸构成的蛋白质。FOXP1编码的蛋白具有多种生物学功能，在胚胎发育中起着重要作用，包括心肌细胞[4]和肺[14]等组织的发育；在免疫调节过程中调控免疫细胞生长发育[15]。FOXP1能够与多种基因的启动子及增强子结合，形成转录复合体发挥调控作用，参与多种基因的表达[16]。有研究发现[4]，敲除FOXP1的小鼠心脏发育存在缺陷，包括流出道分隔、心肌细胞增殖和成熟障碍、心肌垫层所需组织重塑三个方面，且FOXP1协同参与机体心脏的基因调控表达[17]。近期研究发现[18]，FOXP1蛋白表达受心肌组织中的miR-678调控，在心肌生长过程中发挥重要作用。由此可见，FOXP1对心脏的生长发育具有影响作用。心肌中的FOXP1已被证明[6]，其可通过抑制NKX2.5表达负调节心肌细胞增殖，FOXP1作为NKX2.5的直接转录阻遏物发挥作用，FOXP1突变可引起心脏转录因子NKX2.5异常激活。NKX2.5已被确定为人类先天性心脏病的一个致病基因[19]，是心肌细胞发育增殖过程中的重要调控因子。越来越多的研究发现[20]，FOXP1参与多种癌症的发生发展，表明其可能是潜在的治疗靶点。本研究对无血缘关系的100例先天性心脏病患者和100例健康对照者的FOXP1外显子片段进行PCR扩增后测序，通过筛查发现了FOXP1编码区4个杂合突变位点，其中FOXP1基因的p.Q71K、p.T245R突变位点在NCBI的GeneBank数据库中没有检索出，为两个首次发现的突变位点，其余两个(rs201138716和rs202173892)已在数据库注册。查阅文献，这4个突变位点均未在健康对照组发现，提示其可能与先天性心脏病存在相关性。