过表达SOCS5对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的作用及机制研究

赵丹，周永升，李艳平，刘海英，张桂琴，张焱

(1.包头市第四医院呼吸内科,内蒙古包头014030;2.内蒙古医科大学第三附属医院普通外科,内蒙古包头014016)

非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是常见的恶性肿瘤，在过去的几十年中，NSCLC的发病率和死亡率不断增加，已经成为全球性的公共卫生问题[1]。尽管目前对NSCLC的认识不断加深，但其治疗效果依然不甚理想，患者5年生存率仍保持在20%以下[2]。分子靶向治疗是目前具有较好前景的治疗方法，但分子靶向药物普遍具有耐药性，因此，研究新的治疗靶点具有重要的价值[3]。肿瘤的增殖和转移是NSCLC进展的主要因素，也是导致患者预后不良的重要原因[4]，故而研究参与NSCLC增殖、转移的潜在分子机制可能是寻找新型靶点的有效途径。细胞因子信号传导抑制因子5 (suppressor of cytokine signaling 5, SOCS5) 位于染色体2p21上，广泛表达于脾脏、淋巴结、胸腺以及骨髓中的原代B和T细胞中，在调节免疫应答方面具有重要作用[5]。近年来研究表明，SOCS5在宫颈癌、肝细胞肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤中表达异常，其可直接或间接参与肿瘤的增殖、转移等恶性生物学行为的调控[6-8]。目前关于SOCS5与NSCLC的研究报道少见，其在NSCLC进展过程中发挥的作用还有待进一步的研究探索。鉴于此，本研究通过癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库验证SOCS5在肺癌中的表达情况，并进行相关实验，以分析SOCS5对NSCLC增殖、迁移和侵袭的作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞系、试剂及仪器 NSCLC细胞系PC-9、A549和SPC-A-1及正常支气管上皮细胞系16HBE购自中国科学院上海细胞库。DMEM F12培养基、RPMI 1640培养基和FBS(美国Hyclone公司)，SOCS5过表达质粒(上海吉凯基因公司)，MTS试验试剂(美国Sigma公司)，Transwell小室和基质胶(美国BD公司)，蛋白质裂解液和BCA蛋白质浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，兔多克隆抗体SOCS5、小鼠单克隆抗体PI3K、兔单克隆抗体pPI3K、兔多克隆抗体Akt、兔多克隆抗体pAkt、兔单克隆抗体mTOR、兔单克隆抗体pmTOR(英国abcam公司)，ECL发光液(北京索莱宝公司)。饱和湿度培养箱(美国Thermo公司)，680型酶联仪、1645050型电泳仪(美国Bio-Rad公司)，CX23光学显微镜(日本Olympus公司)，SCIENTZ-1200E超声仪(上海颐习仪器设备公司)。

1.2细胞培养及SOCS5过表达质粒转染 NSCLC细胞系PC-9、SPC-A-1和正常支气管上皮细胞系16HBE复苏后重悬于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，A549细胞复苏后重悬至含10%FBS的DMEM F12培养基中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。将呈对数生长的PC-9细胞以3×105个/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，试验设对照(NC)组和SOCS5过表达质粒转染(oe-SOCS5)组，细胞培养12 h时，将8 μL脂质体2000转染试剂、10 μg对照质粒与2 mL无血清培养基完全混匀后加入NC组细胞中，8 μL脂质体2000转染试剂、10 μg SOCS5过表达质粒与2 mL无血清培养基完全混匀后加入oe-SOCS5组细胞中，转染12 h后更换新鲜培养基。

1.3MTS试验检测细胞增殖 将对数生长期的PC-9细胞以1 500个/孔的细胞密度铺至96孔细胞培养板中，实验设NC组和oe-SOCS5组，每组设置6个复孔，细胞接种12 h时，将0.8 μL脂质体2000转染试剂、1 μg对照质粒与0.2 mL无血清培养基完全混匀后加入NC组细胞中，0.8 μL 脂质体2000转染试剂、1 μg SOCS5过表达质粒与0.2 mL无血清培养基完全混匀后加入oe-SOCS5组细胞中进行转染。分别在细胞转染的第0、24、48和72小时，加入MTS试剂，继续在细胞培养箱中温育2 h后采用680型酶联仪检测各孔在波长490 nm处的吸光度(A)值。试验重复3次并进行统计分析。

1.4划痕试验检测细胞迁移能力 取上述转染NC和oe-SOCS5 48 h的PC-9细胞接种于6孔细胞培养板中，每组设置3个复孔，待细胞的融合度达95%时，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁后，在6孔细胞培养板正中间用划痕器垂直划一条划痕，去除脱落的细胞，加入无血清培养基，光学显微镜下观察划痕宽度，培养48 h后显微镜下再次观察划痕宽度变化。划痕愈合比=1-(48 h划痕宽度/0 h划痕宽度)×100%。实验重复3次并进行统计分析。

1.5Boyden试验检测细胞侵袭能力 BD基质胶按1∶10稀释后铺至Transwell小室中制成Boyden小室。取上述转染6孔细胞培养板中NC和oe-SOCS5组培养48 h的PC-9细胞，无血清培养基洗涤3次后，用无血清培养基配成浓度为1×106/mL的细胞重悬液，取100 μL加入至基质胶，下室加入500 μL完全培养基。24 h后终止培养，甲醇固定细胞，吉姆萨染色，显微镜下拍照，计数细胞穿膜数。实验重复3次并进行统计分析。

1.6western blot检测 取上述转染的PC-9细胞1×107个，PBS洗涤3次后，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白质裂解液，采用超声仪破碎裂解后14 000 r/min离心30 min。采用BCA蛋白质浓度检测试剂盒检测上清液蛋白质浓度，行含10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(80 V，100 min)分离蛋白质，蛋白质湿法转印至PVDF膜上，80 g/L脱脂奶粉溶液室温温育PVDF膜1 h，PVDF膜与目的一抗(兔多克隆抗体SOCS5、小鼠单克隆抗体PI3K、兔单克隆抗体pPI3K、兔多克隆抗体Akt、兔多克隆抗体pAkt、兔单克隆抗体mTOR、兔单克隆抗体pmTOR，1∶500稀释)4 ℃摇床上温育过夜，加入羊抗兔IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体(1∶8 000稀释)室温温育2 h，ECL化学发光法曝光条带。蛋白质条带灰度值用ImageJ软件测定，目的条带相对灰度值=目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值。实验重复3次并进行统计分析。

1.7TCGA数据库查询SOCS5在肺癌中的表达情况 采用TCGA数据库查询SOCS5在肺腺癌和肺鳞癌中的表达情况，在浏览器中输入网址http://ualcan.path.uab.edu/index.html，之后点击“TCGA analysis”按键，在搜索框中输入“SOCS5”，同时在肿瘤类型中选定肺腺癌或肺鳞癌，直接查询。在弹出的分析链接中选择“表达”，即可直接得到SOCS5在肺腺癌和肺鳞癌中的表达图以及统计学结果。

2 结果

2.1TCGA数据库分析SOCS5在肺癌组织中的表达水平 采用TCGA数据库分析SOCS5在肺癌组织中的表达水平，结果显示SOCS5mRNA在515例肺腺癌组织中的表达水平低于在59例正常肺组织中的表达(P<0.05)。SOCS5mRNA在503例肺鳞癌组织中的表达水平低于在52例正常肺组织中的表达(P<0.05)。见图1。

2.2western blot检测SOCS5在NSCLC细胞系中的表达水平 SOCS5在NSCLC细胞系PC-9、A549和SPC-A-1细胞中的表达水平[分别为(0.12±0.03)、(0.33±0.11)、(0.32±0.09)]均低于在正常支气管上皮细胞系16HBE中的表达(1.01±0.05),差异有统计学意义(F=76.898，P=0.000)，见图2A。进一步进行组间两两比较，结果发现SOCS5在PC-9细胞中的表达最低(PC-9 vs A549、SPC-A-1、16HBE的LSD-t值分别为3.348、3.189、14.191，P值分别为0.010、0.013、0.000)，故而选择PC-9进行SOCS5过表达质粒转染，用于后续实验。

2.3western blot检测SOCS5过表达质粒转染效果 SOCS5在oe-SOCS5组细胞中的表达水平(4.54±0.94)明显高于在NC组细胞中的表达水平(1.01±0.02)，差异有统计学意义(t=6.503，P=0.003)。见图2B。

2.4MTS试验检测细胞增殖能力 SOCS5过表达质粒转染NSCLC细胞PC-9后，MTS试验检测结果显示，与NC组相比，oe-SOCS5组细胞增殖能力降低(P<0.05)。见图3、表1。

表1 不同时间点NC组和oe-SOCS5组细胞的A值

2.5划痕试验检测细胞迁移能力 检测结果显示，NC组的细胞划痕愈合比为(41.27±3.58)%，明显高于oe-SOCS5组(10.25±4.98)%，差异有统计学意义(t=8.760，P=0.001)。见图4A。

2.6Boyden试验检测细胞侵袭能力 检测结果显示，SOCS5过表达质粒转染NSCLC细胞PC-9后， NC组的细胞穿膜数为(126.67±13.87)个，明显高于oe-SOCS5组的细胞穿膜数[(52.33±9.35)个]，差异有统计学意义(t=7.698，P=0.002)。见图4B。

2.7western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路活性 检测结果显示，SOCS5过表达质粒转染NSCLC细胞PC-9后，与NC组相比，oe-SOCS5组细胞PI3K、Akt和mTOR总蛋白质的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，而pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白的表达降低(P<0.05)。见图5、表2。

3 讨论

研究表明，包含1个中央Src-同源结构域和1个C末端保守的SOCS结构域的SOCS蛋白家族在细胞因子信号转导的调控中起关键作用。越来越多的证据表明，SOCS家族成员与炎性疾病和多种恶性肿瘤密切相关，其成员的异常表达参与了这些疾病的发生和进展[9-10]。家族成员之一的SOCS5与TH细胞分化有关，尤其在维持TH1和TH2细胞之间的平衡中发挥重要作用[5]。近年来的研究发现,SOCS5的表达异常与肿瘤的发生、发展相关，SOCS5可以调控急性淋巴细胞白血病细胞的生长和细胞周期，SOCS5沉默诱导Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号转导激活，促进急性淋巴细胞白血病的发生[11]。SOCS5在肝细胞肝癌组织中过表达，并与患者的预后呈负相关，SOCS5过表达促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭[7]。由此可见，SOCS5既可以发挥癌基因的功能，又可以发挥抑癌基因的功能，其功能的发挥取决于肿瘤类型。

TCGA数据库是由美国国家肿瘤研究所和美国国家人类基因组研究所共同组建，是研究肿瘤的重要资源。本研究通过在TCGA数据库中搜索，发现SOCS5在肺腺癌和肺鳞癌中的表达均降低，且通过细胞实验证实，SOCS5在NSCLC细胞中的表达均低于在正常支气管上皮细胞系16HBE中的表达，这与TCGA数据库中SOCS5在肺癌组织中的表达情况具有一致性，SOCS5在NSCLC中呈异常低表达，提示SOCS5在NSCLC中可能发挥抑癌因子的作用。既往研究显示，SOCS5的表达异常与肿瘤的增殖和迁移相关[6-8]。本研究在NSCLC细胞中转染SOCS5过表达质粒，结果显示SOCS5可以抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力，表明SOCS5在NSCLC中下调可促进肿瘤的恶性进展，与Sharma等[11]在白血病中的研究结果具有一致性，但与Zhang等[7]在肝细胞癌中的报道结果相反，分析原因可能与调控的作用机制相关，因此其作用机制仍需进一步研究。PI3K/Akt/mTOR信号通路是促进肿瘤增殖和转移的重要信号通路之一，该信号通路在NSCLC中处于激活状态[12-13]。在肝细胞癌[7]、骨肉瘤[14]中SOCS5均可通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与肿瘤的恶性进展。本研究结果显示，SOCS5过表达可降低pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白的表达，即在NSCLC中SOCS5过表达可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，这可能是SOCS5调控NSCLC恶性生物学行为的分子机制之一。本研究还发现SOCS5在NSCLC中呈低表达，并能通过调控经典的肿瘤相关信号通路PI3K/Akt/mTOR，参与肿瘤细胞的恶性进展。但是肿瘤的调控错综复杂，SOCS5抑制NSCLC细胞进展的过程也可能涉及多种信号途径，而本实验仅研究了1条信号通路；另一方面，本研究仅分析了过表达SOCS5对NSCLC细胞恶性进展的影响，并未分析抑制SOCS5表达时的情况，若加入该部分内容将使得研究结果更具说服力，这些不足之处将在后续研究中不断完善。

表2 NC组和oe-SOCS5组细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达