miR-30d-5p调控人口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的作用机制研究*

周沛玲，严海超，游巧玲，延丽雅，周腾田

东莞市大朗医院口腔科，广东 东莞 523770

关健词：人口腔鳞癌细胞；miR-30d-5p；细胞增殖；细胞凋亡

口腔鳞癌是头颈部常见恶性肿瘤，恶性度高、易早期发生转移，且局部复发率高、预后较差，因而深入了解其发生发展机制具有重要临床意义［1］。miRNA参与肿瘤细胞多种生物行为学，包括细胞分化、增殖、凋亡和代谢。在口 腔 鳞 癌 中， 包 括miR-655， miR-143， miR-1246，miR-221，miR-21，miR-135b，miR-29c 等 多 个miRNA参与肿瘤形成、侵袭和转移［2-5］。我们既往发现自噬相关基因Beclin1 与口腔鳞癌分化、浸润和转移密切相关［6］，采用Tarbase、miRDB、miRWalk 和TargetScan 数据库分析显示Beclin1 与miR-30d-5p 高度关联、Beclin1 可能是他们下游靶基因。文献显示miR-30d-5p 参与了多种细胞生物学行为，如细胞自噬、细胞凋亡和细胞增殖侵袭［7-9］。然而尚不清楚miR-30d-5p 在调控人口腔鳞癌细胞（TSCC1）增殖和凋亡中发挥的作用，本研究旨在探寻上述作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

人口腔鳞癌组织，获得医院伦理委员会批准后收集中山大学附属肿瘤医院住院收治的口腔鳞状细胞癌患者，并收集术中切除的癌组织及癌旁组织标本，标本例数共收集20例。所有患者均签署知情同意书。癌旁组织取自结口腔鳞癌组织＞5 cm 的组织标本，取标本后迅速放置在-80 ℃冰箱中保存待用。收集患者完整病例资料、临床随访资料。

1.2 试剂耗材

TSCC1 购于美国Cellosaurus 公司，Trizol 购自Invitro⁃gen，MEM 培养基购自Gibco，Real-Time PCR 试剂盒购自Tiangen，MTT 试剂盒购自碧云天公司，TUNNEL 试剂盒购自Roche 公司， Beclin1 siRNA 购自百恩维生物，miR-30d-5p mimic 和模拟物对照、miR-30d-5p 抑制剂和抑制剂购自广州锐博公司。

1.3 细胞处理

培养TSCC1 细胞，依据Lipo 3000 说明书进行转染，将miR-30d-5p 和miR-control、miR-30d-5p inhibitors 和anti-miR-control转染至TSCC1，转染24小时后更换新鲜的培养基，MTT检测细胞增值率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。构建Beclin1 siRNA。qPCR 测TSCC1 细胞中Be⁃clin1 表达情况以确保沉默效率；检测Beclin1 沉默对TSCC1细胞的增殖凋亡的影响。

1.4 MTT实验

取对数生长期细胞铺于96 孔板中，采用上述细胞处理，处理后24 h、48 h及72小时后每孔加入MTT 100 μL，按照说明书进行操作，最后使用酶标仪在570 nm波长检测各孔吸光度值。细胞存活率=测试组OD 平均值/对照组OD平均值×100%。

1.5 流式细胞实验

依据说明书将细胞接种于6 孔板，采用上述不同分组刺激后，参照说明书操作、加入Annexin V-FITC 5μL 和10 mg/L 碘化丙啶（PI）10 μL，最终流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。增殖指数（PI）=（S+G2/M 细胞数）/（G0/G1+S+G2/M 细胞数）×100%；凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/细胞总数。

1.6 RNA提取和qPCR

收集处理好的各组细胞、PBS 洗涤后提取RNA，逆转录为cDNA。ABI PCR 仪进行扩增，程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40 次循环后，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃再变性15 s，GAP⁃DH或U6作为内参，见表1。

2 结果

2.1 miR-30d-5p在口腔鳞癌中表达模式

我们既往发现自噬相关基因Beclin1 与口腔鳞癌分化、浸润和转移密切相关［6］，本研究采用Tarbase、miRDB、miRWalk 和TargetScan 数据库分析显示Beclin1 与miR-30d-5p 和miR-548b-3p 高度关联、存在多个结合位点，提示Beclin1 可能miR-30d-5p 和miR-548b-3p 下游靶基因。随后我们取20例患者的口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织，提取RNA、qPCR 显示miR-30d-5p在口腔鳞癌组织中显著高表达、Beclin1 在口腔鳞癌组织中显著低表达，两者呈负相关（P＜0.05），而miR-548b-3p 在口腔鳞癌组织中表达稍高于正常组织。因此，我们选择miR-30d-5p进行后续研究，见图1。

2.2 miR-30d-5p和Beclin1对TSCC1细胞增殖的影响

表1 引物序列

图1 miR-30d-5p在口腔鳞癌中表达模式

为了检测miR-30d-5p 质粒的有效性，首先采用12.5、25 及50 nmol/L 浓度的质粒（miR-30d-5p mimics 和miR-control、 miR-30d-5p inhibitors 和anti-miR-control）转染TSCC1 细胞， qPCR 结果显示与对照组比较miR-30d-5p mimics 和inhibitors 能够分别显著促进和抑制TSCC1 细胞内miR-30d-5p 的表达，效果呈浓度依赖性，差异均有统计学意义（P＜0.05），随后采用50 nmol/L 的miR-30d-5p mimics 或inhibitors 进行后续实验。同时我们采用si-Beclin1 质粒转染TSCC1 细胞，荧光显微镜显示转染效果良好，TSCC1细胞发红色荧光（RFP）；qPCR检测显示转染后24 h 人TSCC1 细胞Beclin1 mRNA 表达显著下降，较对照组相比至少下降了80%以上，提示干扰效果良好，见图2。

图2 RT-PCR检测miR-30d-5p和si-Beclin1转染效果

为了验证对TSCC1 细胞增殖的影响，分别转染miR-30d-5p mimics、 miR-control、 miR-30d-5p inhibi⁃tors、anti-miR-control 和si-Beclin1，处理0、2、3、5 和7天中断反应，MTT 检测发现miR-30d-5p mimics 促进TSCC1 细胞增殖，miR-30d-5p inhibitors 能够抑制TSCC1细胞增殖；si-Beclin1 抑制Beclin1 表达后TSCC1 细胞增殖率升高，见图3。

2.3 miR-30d-5p和Beclin1对TSCC1细胞凋亡的影响

图3 miR-30d-5p和Beclin1对TSCC1细胞增殖的影响

为检测miR-30d-5p 和Beclin1 对TSCC1 细胞凋亡的影响， 分 别 转 染 miR-30d-5p mimics、 miR-control、miR-30d-5p inhibitors、anti-miR-control 和si-Beclin1，处理后24 小时采用流式细胞仪检测凋亡情况。结果显示miR-30d-5p mimics 和si-Beclin1 能抑制TSCC1 细胞凋亡，miR-30d-5p inhibitors 能促进TSCC1细胞凋亡，见图4。

图4 miR-30d-5p和Beclin1对TSCC1细胞凋亡的影响

3 讨论

口腔癌是指发生于口腔及其邻近解剖结构的恶性肿瘤，是头颈部常见恶性肿瘤，位居全身恶性肿瘤第6位，且其发病率呈逐年递增趋势。90%以上口腔癌为鳞状细胞癌（简称鳞癌），主要发生于40～70岁的中年及老年人［10］。口腔癌鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）恶性度较高、容易早期发生淋巴结转移，并且口腔鳞癌局部复发率高、预后较差，尽管目前恶性肿瘤的治疗进展显著，口腔鳞癌的5年生存率仍维持在41%～79.5%之间［11］。目前针对口腔鳞癌仍采取手术切除为主，放化疗辅助的治疗措施。多数患者即使存活下来，但手术造成的颜面部缺损会严重影响患者的心理和生活质量。虽然目前研究已证实口腔鳞癌是一个多基因、多通路共同参与的疾患，但其具体调控机制尚未阐明。因此，口腔鳞癌的发生发展机制全面深入研究，对于口腔鳞癌的药物研发和个体化治疗均具有重要的现实意义。

miRNA是最重要的一类非编码RNA，广泛分布于人体各器官和组织；大量功能各异的miRNAs 能调控人体多种基因的表达水平，参与多种细胞生物行为学活性，包括细胞分化、增殖、凋亡和代谢。在口腔鳞癌中，包括miR-655， miR-143， miR-1246， miR-221， miR-21，miR-135b，miR-29c 等多个miRNA 参与肿瘤形成、侵袭和转移［2-5］。Zhao 等［7］发现miR-30d-5p 在缺氧缺血性损伤后的发育中大鼠脑中的自噬和细胞凋亡中起着重要作用，miR-30d-5p 能减少缺氧缺血性损伤后大鼠的脑梗体积、促进神经系统恢复并改善行为学表现。He 等［8］发现miR-30d-5p 通过LDHA 调节胆囊癌的侵袭性，miR-30d-5p 在胆囊癌组织中低表达，表达低的患者预后不良。Song 等［9］发现miR-30d-5p 的过表达抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭，诱导细胞阻滞于G0/G1 期和细胞凋亡。Wu 等［10］发现miR-30d-5p 下调后解除对Runx2 的抑制，最终促进干细胞成骨分化。因此miR-30d-5p 的功能具有组织特异性，然而目前尚无有关miR-30d-5p 在口腔鳞癌中的作用机制研究。

我们既往研究发现Beclin1 在口腔鳞癌旁非肿瘤上皮组织中表达最高、癌组织中表达其次、“瘤芽”组织中表达最低；“瘤芽”中Beclin1 表达低者，患者口腔鳞癌的恶性程度更高、TNM分期更差；研究提示口腔鳞癌组织“瘤芽”中Beclin1 表达与口腔鳞癌侵袭、转移密切相关［6］。本研究数据库分析显示miR-30d-5p和Beclin1呈强关联，qPCR验证miR-30d-5p 在口腔鳞癌组织中高表达、Beclin1 在口腔鳞癌组织中低表达，两者呈负相关）。转染miR-30d-5p能够促进TSCC1 细胞增殖、抑制TSCC1 细胞凋亡；而miR-30d-5p inhibitors 抑制TSCC1 细胞增殖、促进TSCC1细胞凋亡。采用Lenti-sh-Beclin1 的慢病毒转染TSCC1 细胞后，TSCC1 细胞增殖下降、凋亡升高。研究提示miR-30d-5p可通过Beclin1调控TSCC1增殖和凋亡。

综上所述，本研究通过siRNA 等试验手段发现miR-30d-5p 可通过Beclin1 调控TSCC1，促进其增殖和抑制其凋亡，其具体作用机制仍有待进一步研究。