补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β的作用研究

王春霞 岳师师 毛炎佳 姜亚茹 刘玉春 燕莎 李永伟

卵泡的生长发育受下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的调控及其相关组织分泌激素的调节，从卵泡的生成到卵子的排出，任何一个环节出现问题均可导致排卵障碍[1]。TGF-β超家族的一个亚型TGF-β1及其受体TGF-β1R 在卵巢不同发育阶段中均可表达[2]。补肾助孕颗粒是王春霞教授在长期临床实践中的经验方，通过多年临床观察对于恢复月经周期，促进排卵具有良好的效果，且临床观察中未发现并发症及副作用[3]。为了解该方对卵泡生长发育的作用，我们用大鼠卵巢颗粒细胞进行实验研究，观察其对TGF-β1及受体浓度变化并进行分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞大鼠卵巢颗粒细胞购自武汉原生原代生物医药科技有限公司，产品编号：RATCELL-0077，规格：5×105cells/ml。

1.2 实验用药与耗材补肾助孕颗粒（菟丝子，规格：10g/袋，批号:1905006C；当归，规格：10g/袋，批号:1906013C；枸杞子，规格：5g/袋,批号:1906001C；熟地，规格：10g/袋,批号:1905004W；制何首乌，规格：10g/袋,批号:1812003C；白芍，规格：10g/袋,批号:1906001W；川芎，规格：6g/袋,批号:1906003C；黄芪，规格：10g/袋,批号:1907001W；炙淫羊藿，规格：10g/袋，批号:1901002C；山药，规格：10g/袋，批号:1904006W；牛膝，规格：5g/袋，批号:1906001C）厂家：三九制药。注射用尿促性素针（HMG），厂家：丽珠集团丽珠制药厂，规格:75U，批号:180504。细胞培养基：批号:0012519，厂家:BI 生物公司。牛血清：批号：1924622，厂家：BI 生物公司。大鼠TGF-β1 试剂盒，批号：201812，上海江莱生物科技公司。大鼠TGF-β1R 试剂盒，批号：201812，上海江莱生物科技公司。

1.3 实验分组选择生长良好的大鼠卵巢颗粒细胞，用细胞计数板进行计数，调整细胞为1×105cells/ml，用96 孔细胞培养板进行培养，并分为对照组（空白）、高剂量组（含生药3.24g/ml）、中剂量组（含生药1.62g/ml）、低剂量组（含生药0.81g/ml）、HMG 组（阳性对照组），每组18 孔，37℃ 5%CO2进行培养，分别在1、6、12、24、48h 离心取培养物上清液，按大鼠TGF-β1 及受体试剂盒操作说明书进行程序设定，用艾德康全自动酶联免疫一体机进行检测，用试剂盒自带标准液绘制曲线进行测定。

1.4 统计学方法采用SPSS 17.0 软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验。计数资料以率（%）表示，采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1 表达量的影响对照组各个时间点TGF-β1 的浓度变化无差异（P＞0.05）；除HMG 组，其他各中药组12h 浓度最高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组用药12h TGF-β1 的浓度高于高剂量组和低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMG 组用药6h TGF-β1 浓度最高，与其他时间点相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中剂量组用药12h 与HMG 组用药6h TGF-β1 浓度相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1R 表达量的影响对照组各个时间点TGF-β1R 的浓度变化无差异（P＞0.05）；除HMG组其他各中药组12h 浓度最高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组用药12h TGF-β1R 的浓度高于高剂量组和低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMG 组用药6h TGF-β1R 最高，与其他时间点相比差异有统计学意义（P＜0.05）。中剂量组用药12h 与HMG 组用药6h TGF-β1R 浓度相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1 表达量的影响情况（，ng/L）

表1 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1 表达量的影响情况（，ng/L）

表2 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1R 表达量的影响情况（，ng/L）

表2 不同含量补肾助孕颗粒对大鼠卵巢颗粒细胞TGF-β1R 表达量的影响情况（，ng/L）

3 讨论

《内经》肾藏精，主生殖，是对人体的生殖功能的高度概括，肾中之精又有先天之精和后天之精，先天之精得到后天之精的濡养得以升华，为肾主生殖的根本[4]。《灵枢·经脉篇》曰“人始生,先成精”。肾中精气是孕育的物质基础，精气的充盈与女性卵泡的生成、发育、成熟密切相关[5]。随着高科技的发展，人们生活节奏的加快，女性承担的压力也随之增大，直接影响到了女性生殖及内分泌功能[6]，出现卵巢早衰、多囊卵巢综合征、闭经、异常子宫出血等疾病的增多，从而影响到女性卵泡的发育、成熟及排出，造成女性不孕症的增多[7]。现代研究发现补肾药物具有类激素样的作用，起到改善女性内分泌的功能，促进卵泡的发育与排出[8]。

补肾助孕颗粒是王春霞教授多年临床观察总结出来的对排卵障碍性不孕症治疗的有效方剂，具有补肾填精调经助孕之功[9，10]。补肾助孕颗粒中熟地、菟丝子能够补肾填精；制何首乌、枸杞子和当归能够滋阴补血；白芍能够养血调经；山药、黄芪能够益气补血；川芎能够行气活血；牛膝能够引血下行；配以炙淫羊藿起到阳中求阴功效。方中的活血化瘀药能改善卵巢微循环，且促进卵泡发育及排卵。方中的补肾药能够增强卵巢和垂体的功能，起到调节内分泌的功能。

TGF-β 是一个庞大的家族，主要以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 为主，参与许多细胞生长过程，包括细胞增殖、分化、迁移和存活，其在胚胎发育中也起着重要作用，其中TGF-β1 的活性最强，功能也最多，临床应用最广泛[11]。活化后TGF-β1 分子量为25Kd，含有112 个氨基酸，由2 条单链组成[12]，TGF-β1 常与其相应受体结合后发挥作用，其在哺乳动物卵巢中主要表达于卵母细胞，促进卵泡的生长发育和卵子的成熟。我们通过实验研究发现，在应用促性腺激素和补肾助孕颗粒都可引起TGF-β1 及其受体在卵泡发育的不同阶段进行表达，对照组各个时间点TGF-β1 及其受体的浓度变化无差异；补肾助孕颗粒各剂量组用药后TGF-β1 及其受体的浓度均高于对照组，以给药后12h 浓度最高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组用药12h TGF-β1 及其受体的浓度高于高剂量组和低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HMG 组用药6h TGF-β1 及其受体浓度最高，与其他时间点相比差异显著（P＜0.05）。中剂量组用药12h 与HMG 组用药6h TGF-β1 及其受体浓度相比差异无统计学意义。所以，促性腺激素和补肾助孕颗粒在卵泡生长发育过程中都能起到促进作用。本研究为补肾助孕颗粒在女性排卵障碍性不孕症的治疗方面提供了实验依据和理论支持。