肉品新型解冻技术及其对蛋白特性影响的研究进展

彭泽宇，朱明明,2,3,*，孙红东，何鸿举，王正荣，赵圣明，康壮丽，马汉军

（1.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003；2.河南科技学院 畜禽产品精深加工与质量安全控制河南省工程技术研究中心，河南 新乡 453003；3.国家猪肉加工技术研发专业中心，河南 新乡 453003）

为确保工业中大规模生产肉制品的安全性和经济性，冷冻贮藏仍是目前国内外肉制品企业最常用的保藏方式[1]。冷冻过程中，冰晶的形成、成长导致肌肉组织的超微结构遭到破坏、干物质浓度增加、化学反应加剧、蛋白变性等，直接影响到肉品质的好坏[2]；而解冻过程中，由于冷冻时形成的冰晶破坏了细胞膜和组织结构，导致冰晶融化产生的水分不能被完全吸收，肉品不可避免会发生汁液流失。肉品汁液流失与其色泽、嫩度、新鲜度等理化指标有直接或间接的联系[3]，使其品质下降。而汁液流失的多少与解冻过程直接相关，所以解冻过程的控制对冷冻肉的品质也起着至关重要的作用，一般需在低温下进行快速解冻，以避免温度过高、产品汁液流失严重等现象。

近些年有研究表明，解冻过程中肌原纤维蛋白的氧化是原料肉品质劣变、汁液流失的重要诱因之一[4]。肌原纤维蛋白是肌肉中主要的功能性蛋白，氧化会诱导其氨基酸侧链羰基化，导致蛋白二、三级结构展开，蛋白热稳定性变差，使其丧失功能。同时蛋白氧化导致蛋白变性，诱导蛋白质交联，从而使肌纤维强烈收缩并导致肌肉持水力、嫩度下降，降低肉及肉制品的营养和加工品质[5]。李银等[6]研究了蛋白氧化对肌肉保水性的影响，发现低温高湿变温解冻可降低蛋白氧化变性程度，缓解肌肉水分“态变”发生，从而改善解冻牛肉保水性；Jia Guoliang等[7]研究发现，与传统空气、流水解冻相比，在高压静电场-10 kV解冻时猪肉肌原纤维蛋白结构较稳定且蛋白氧化程度较低；姜晴晴等[8]得出了低温解冻处理对带鱼蛋白品质危害最小的结论。不同解冻技术对肉制品中蛋白质影响极其不同，因此为保证肉制品的品质，需要选择合适的解冻技术。

目前，传统的肉类解冻技术主要包括空气、水和低温解冻等，但其耗时长、效率低，且会导致肉品质恶化等，促使了新型解冻技术快速发展与应用，如微波、高压静电场、射频、超声波、远红外等因其各自的特点，近年来备受关注[9-10]。本文简要介绍肉品新型解冻技术的优缺点及其在冻结肉领域的最新应用进展，并重点对解冻过程中蛋白氧化、构象改变及聚集特性的变化进行全面综述，阐明蛋白氧化与肉制品保水性的关联机制，以期为新型解冻技术更加合理、高效地应用于肉品加工业提供理论依据。

1 肉品新型解冻技术

近年来，国内外学者针对新型解冻技术在冷冻肉的应用进行了大量的实验研究，包括微波、高压静电场、射频、超声波、远红外等技术。这些新型解冻技术可有效提高解冻效率，但因其研究不够成熟、成本高及其所产生的不良影响制约了其在工业上的广泛应用[11]。

1.1 微波解冻技术

微波解冻因具备高效解冻的特点而成为近年来代替传统空气解冻应用于肉品工业中的新型快速解冻技术。其原理是利用电磁波使食品内部分子所带电荷方向不断发生变化，导致分子间摩擦产热实现对食品的解冻[12]。微波解冻的功率、频率以及间隔时间是影响解冻效果的重要参数。已有研究表明，微波解冻可明显缩短解冻时间，同时能有效维持原料肉的色泽、嫩度及质构特性[13-14]。然而，值得注意的是，微波解冻过程中易出现热分布不均的问题，这与微波功率相关。Kim等[15]研究发现随着微波功率的增大，解冻速率加快，但当功率大于250 W时解冻肉则出现热分布不均匀、边缘熟化、色泽变差、保水性下降等问题。Chamchong等[16]也报道了微波解冻功率过大会造成解冻产品品质下降的问题。因此，选择适宜的微波功率并解决微波过程中热分布不均的问题是微波解冻技术能否广泛应用于肉类工业的关键。

表1 微波联合解冻在冷冻肉品中的应用Table 1 Application of microwave-assisted thawing in frozen meat products

冷冻肉中未形成冰的液态水对微波的优先吸收是造成热分布不均的主要原因。早年的研究主要通过控制产品几何形状等方法来提高微波加热的均匀性，但这些方法局限于特定的条件，不能广泛应用于工业生产中[12]。近几年，许多学者开始关注微波与其他解冻工艺相结合，以此来改善解冻产品品质，解决加热不均的问题，并获得预期效果。如表1所示，Jin Jiahui等[17]发现先微波再空气、超声解冻可改善局部过热问题，提升解冻牛肉品质。Cai Luyun等[18-19]研究表明微波联合真空或超声解冻能提升红鼓鱼和真鲷鱼蛋白热稳定性，更好地保持产品的品质。Cao Minjie等[20]也发现将磁性纳米粒子与微波结合能较好地保持冷冻真鲷鱼片的品质。因此，微波联合解冻在肉类工业中应用具有较大的潜力。

1.2 高压静电场解冻技术

高压静电场加工技术作为一项高效安全的非热加工技术已应用于食品干燥、杀菌、冷冻、解冻等多个领域[21-23]。其原理是，闭合电路时高压静电场会产生电晕风，电晕风内高速运动的带电粒子冲击解冻产品增加了传热系数，从而提升解冻效率[24]。近年来，随着高压静电场加工技术受到广泛的关注，已有学者研究发现，高压静电场解冻技术具有高效、节能、解冻均匀、解冻后肉品品质明显改善等特点，且随着电压的增加，解冻速率会加快[25-26]。Jia Guoliang等[7]研究表明，与传统空气解冻和水解冻相比，高压静电场解冻能降低冷冻猪肉蛋白氧化变性程度，保持肌原纤维蛋白结构的完整性。Rahbari等[27]发现适当地提高电场强度有助于提高解冻鸡胸肉保水性、蛋白溶解度，降低蛋白变性程度，有利于维持产品品质。另外，何向丽[28]发现高压静电场解冻技术是一种低耗节能的选择。然而，高压静电场解冻的电压大小、电极针数、电极间距以及解冻环境对解冻效果都有较大的影响。已有报道显示，电压水平过高可能导致臭氧产生，引发鸡胸肉样品蛋白质氧化和脂质氧化[27]。因此为其能被广泛应用，未来仍需完善其参数设置，并探究其改善肉质的机理。

1.3 射频解冻技术

射频解冻的原理为产品通过交变电磁场时，其内部离子朝着电荷相反方向运动，导致离子间摩擦、振动并发生偶极旋转在产品内部产生热量，从而实现对产品的快速解冻[11]。频率、功率和极板间距等参数对解冻效果影响较大。Cathcart等[29]最早证明了射频技术应用于食品解冻的可行性，并发现与传统解冻方法相比，射频解冻能明显缩短解冻时间，维持解冻产品的品质。郭洁玉[30]的研究结果也表明，白猪肉在射频解冻时效率最高，且解冻后的解冻损失、色泽变化、微观结构变化最小。但是Marra等[31]发现随射频功率增大，解冻温度出现分布不均匀现象，这也是制约其工业化的关键技术难题。为减缓解冻样品表面温度分布不均的状况，Uyar等[32]建立计算模型来探究冷冻牛肉在解冻过程中的温度分布，并对模型进行实验验证，以证实该模型的可行性，但这些大大增加了投资成本，且对设备技术要求很高，导致其难以工业化应用。

1.4 超声波辅助解冻技术

超声波技术应用于食品的解冻主要依赖它的热效应机制，即超声波在介质中机械振动，使介质中的粒子产生能量并被吸收转化成热能[33]。超声波解冻的优势在于提升解冻速率的同时可有效改善原料肉解冻不均匀的问题[34]，因此近几年得到广泛应用。解冻效率与选择超声波的频率和功率密切相关。Gambuteanu等[35]的研究表明，在恒定温度下，与传统水解冻相比，猪肉经低强度超声波解冻的时间缩短，但品质无明显差异。蒋奕等[36]发现随着超声功率的增大，猪肉保水性下降。余力[37]和张昕[38]等的研究结果也表明，超声波解冻可提高兔肉和鸡胸肉的解冻速率，但易引发大量的汁液流失，造成负面影响。另外超声波辅助解冻作为一种新型的解冻技术，自身还有一些问题，如能耗大、穿透性差、会影响产品活性成分等[39]，使其应用有一定的局限性；因此选择合适的频率和强度是超声波辅助解冻技术保证产品品质的关键。

1.5 远红外解冻技术

红外辐射是一种电磁辐射，基于它的波长可将其分成3 个区域，即近红外区、中红外区和远红外区。远红外技术因节能高效且对含水物质以及多数有机物有强烈的吸收带而经常被用到食品加工中，相较于红外干燥、红外杀菌技术而言，远红外解冻技术受到的关注较少。远红外解冻技术的原理与微波、射频解冻相似，都是以电磁波形式引起分子剧烈运动并将能量转化为热能进行解冻[40]，其解冻效果取决于辐射强度等参数。目前，远红外技术主要用于冷冻肉品的联合解冻，其单一解冻的研究较少。Hong等[41]首次将远红外与鼓风技术相结合，应用于猪肉解冻。另外，与单独鼓风解冻相比，经联合解冻后，猪肉的汁液损失明显降低，但红外辐射剂量过高则会降低猪肉的保水性和嫩度。Cao Minjie等[20]的研究结果也证实了磁性纳米粒子与远红外结合能较好地保持真鲷鱼片的品质，同时可维持其肌原纤维蛋白结构，使其接近新鲜水平。总体来说，远红外技术对改善解冻肉制品品质特性具有十分重要的意义，但该技术也具有一定局限性，与微波解冻技术相比其穿透能力较差，因此该技术适合与其他解冻技术联合使用。

2 解冻对肉品蛋白质氧化程度（理化性质）的影响

近年来研究者开始逐渐关注蛋白氧化对解冻产品品质的影响，有报道称肉品解冻后保水能力、嫩度的变化在一定程度上与蛋白质氧化有关，冷冻贮藏会增加肉类蛋白质在解冻过程中进一步氧化的敏感性[3]。Xia Xiufang等[42]的研究也得出了解冻会增加猪肉肌原纤维蛋白氧化程度的结论。因此，如何改善解冻过程中肉品蛋白质氧化的程度是研究解冻技术的关键之一。目前主要通过测定羰基含量、巯基含量、二聚酪氨酸含量、蛋白表面疏水性、蛋白热变性、流变特性以及ATPase活力的变化来表征解冻过程中蛋白质氧化程度，具体测定方法如表2所示。

表2 蛋白质氧化程度评价指标及测定方法Table 2 Evaluation methods for protein oxidation degree

2.1 解冻过程中肉品蛋白质羰基、巯基含量的变化

蛋白质的氧化修饰可能发生在氨基酸的侧链和肽链主干上，导致蛋白特性发生变化即出现羰基衍生物生成、巯基损失和共价交联等现象[5]。随着氧化程度的提高，羰基、共价交联产生的二聚酪氨酸含量增高，巯基含量降低[46-47]。朱文慧等[43]研究发现不同解冻方式均会增大秘鲁鱿鱼蛋白氧化程度，即表现为羰基、二聚酪氨酸含量增加以及巯基含量减少。宦海珍等[48]也报道了微波功率为500 W时解冻秘鲁鱿鱼蛋白羰基、二聚酪氨酸含量较低，巯基含量较高，而Cui Yan等[49]通过测定银鲳鱼蛋白羰基和巯基含量得出100 MPa为最佳高静压解冻参数，其氧化程度较小的结论。因此，可通过测量解冻肉品中羰基、二聚酪氨酸以及巯基的含量来判断其蛋白氧化程度。

2.2 解冻过程中肉品蛋白质表面疏水性的变化

表面疏水性是指由于水对非极性分子的排斥，非极性基团在水中出现相互缔合的趋势。其与蛋白质表面性质、空间结构以及脂肪结合能力有密切联系，并且具有监测蛋白质理化状态细微变化的能力[44]。正常情况下，肌原纤维蛋白的疏水区在分子内部，而解冻会导致蛋白质结构展开，暴露疏水区，从而增加蛋白的表面疏水性。Sun Weizheng等[50]报道了蛋白氧化会暴露其疏水性氨基酸残基，影响蛋白质与水的结合能力，从而导致保水性下降。尚柯等[51]研究发现，传统冻结与解冻方法会使牛肉肌原纤维蛋白表面疏水性增加，降低蛋白水合能力；而低压静电场冻结与解冻可抑制疏水残基的暴露。因此，表面疏水性可以作为判断蛋白质氧化程度的合适参数，应用于解冻肉品评价体系。

2.3 解冻过程中肉品蛋白质热变、流变特性及溶解度的变化

解冻过程中，蛋白质的氧化变性可导致肉品持水力下降，其变性程度可通过DSC分析、流变特性以及蛋白溶解度等指标来衡量。DSC分析技术具有高灵敏度、快速等特点，常通过变性温度和热焓值来衡量蛋白质的变性程度[45]。Cai Luyun等[18]研究表明微波和超声结合真空解冻后样品的蛋白热焓值较高，热稳定性较好，蛋白变性程度较小。流变仪可在不破坏蛋白样品结构的前提下，研究解冻肉的结构、凝胶强度以及蛋白交联度，其中常通过储能模量（G’）的变化来反映肉制品的动态流变学特性[52-53]。彭泽宇等[54]报道了在低温、相对湿度为90%和95%条件下解冻的猪肉，其G’值维持较好。Amiri等[55]研究发现增加高压静电场电极针数可改善牛肉肌原纤维蛋白的流变特性。蛋白质在水中的分散水平被称为蛋白溶解度，有研究表明蛋白溶解度与一些功能特性如乳化、增稠、凝胶性的表达相关[38,45]。蛋白溶解度的变化是蛋白质分子间相互作用、蛋白质与水之间相互作用平衡转变的结果。解冻过程会导致蛋白质分子间相互作用增强，而蛋白质-水相互作用减弱。朱明明等[14]研究发现快速与慢速解冻后猪肉蛋白溶解度均明显下降。因此，蛋白变性程度会随蛋白溶解度的减小而增大。

2.4 解冻过程中肉品蛋白质ATPase活性的变化

ATPase活性是判断肌球蛋白完整性的一个指标，而研究表明肉品的凝胶强度与肌球蛋白的完整性相关[56]，因此，ATPase活性成为了决定产品凝胶特性的重要因素之一。有研究表明肌原纤维蛋白ATPase活性与肌球蛋白头部区域巯基的氧化密切相关[57]。Benjakul等[58]报道称，冷冻、解冻过程可能会诱导肌肉蛋白重排列并导致其ATPase失活。因而，近几年ATPase活性因与肌肉中蛋白氧化、变性密切相关而成为评估解冻技术的一项指标。Jia Guoliang等[7]研究了高压静电场下不同电压对猪肉肌原纤维蛋白变性的影响，结果表明在-10 kV下解冻，Ca2+-ATPase活力最高，蛋白变性程度较小。Xia Xiufang等[42]报道，ATPase活性与解冻的温度相关，温度越高则ATPase活力越低。

3 解冻对肉品蛋白质构象的影响

3.1 解冻过程中肉品蛋白质二级结构的变化

蛋白二级结构是指蛋白内部局部肽段骨架形成的构象，其中主要包含α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲等结构，是从空间结构研究蛋白作用机理和功能的重要指标[59]。解冻会导致α-螺旋含量降低，分析原因可能是由于冻结过程中，冰晶的增大对蛋白造成挤压及机械刺伤，而解冻过程又破坏了分子的内部氢键[60]。目前常用圆二色光谱（circular dichroism，CD）法、傅里叶变换红外光谱（Fourier transformation infrared spectroscopy，FTIR）法以及拉曼光谱法来分析解冻过程中蛋白质二级结构的变化。CD法主要是通过测定α-螺旋结构两个特征负峰的光谱变化来估算其含量，从而判断蛋白二级结构的变化。Jia Guoliang等[7]使用CD法研究发现，与新鲜猪肉相比，不同解冻方式均会降低α-螺旋结构的含量，其中空气解冻后猪肉的α-螺旋结构含量最低，高压静电场解冻后的α-螺旋结构含量最高且解冻后蛋白结构较稳定。Li Fangfei等[61]也通过CD法得出了不同解冻方法均会使α-螺旋结构含量降低的结论。而FTIR法和拉曼光谱法则都是通过分析酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）的变化来判断蛋白质二级结构的变化，不同的蛋白质二级结构在酰胺I带上有其对应的特征波段[62]。利用FTIR法分析蛋白氧化程度对肌原纤维蛋白结构的影响时，发现随着氧化程度增大，α-螺旋含量减少，而β-折叠及无规卷曲结构含量增加[63]，表明解冻过程中α-螺旋结构可能转变为β-折叠或无规卷曲结构。孙圳等[64]通过FTIR法分析得出采用较低温度冻结，解冻后能较好地保持牛肉肌原纤维蛋白二级结构的结论。由于FTIR法测量步骤较复杂，即测量前蛋白样品需要冷冻干燥，因此也有研究通过拉曼光谱法分析蛋白质二级结构的变化。Cai Luyun等[19]分析了不同解冻方式下红鼓鱼肌原纤维蛋白的拉曼光谱，发现超声结合微波或远红外解冻其α-螺旋含量显著高于单一解冻方式且接近鲜鱼水平。

3.2 解冻过程中肉品蛋白质三级结构的变化

蛋白质的三级结构是指蛋白质多肽链在二级结构基础上通过侧链基团相互作用折叠形成的一个紧密的三维空间结构，其结构稳定性主要依靠氨基酸残基侧链之间的疏水作用力维持。目前常利用色氨酸作为内源荧光探针研究蛋白质三级结构的变化[65]。蛋白质发生氧化变性时，蛋白质结构随之展开，部分色氨酸残基所处环境极性增加，会导致最大荧光发射波长增大即发生红移。红移程度越大，表明蛋白质三级结构变化越大[66]。Cai Luyun等[18]研究发现，与鲜红鼓鱼相比，所有解冻方式肉样蛋白结构均发生改变，其中低温解冻、微波解冻、超声解冻其蛋白最大荧光发射波长发生红移；而微波复合真空解冻红鼓鱼蛋白最大荧光发射波长发生蓝移，蓝移则表明色氨酸侧链基团所处环境极性降低，但其荧光强度低于其他所有组，可能是微波复合真空解冻后部分蛋白质在解冻过程中发生二次折叠，表明解冻过程中样品蛋白局部结构会发生变化。Zhang Mingcheng等[67]研究发现冻融后猪肉肌原纤维蛋白的荧光强度显著低于新鲜肉样，这是解冻导致色氨酸残基暴露在亲水环境中，使其发生荧光猝灭造成的[4]。

4 解冻对肉品蛋白质聚集特性的影响

4.1 解冻过程中肉品蛋白质聚集程度的变化

在解冻过程中肉品蛋白质氧化可能会导致其内部发生聚集和交联，影响其平均粒径的变化。因此可通过测定肌原纤维蛋白的粒径分布以及平均粒径的大小来判断解冻方法对其聚集程度的影响[68]。粒径峰值越高、平均粒径越小，其聚集程度越低[69]。Li Fangfei等[61]研究发现猪肉经不同方式解冻后蛋白平均粒径均有上升趋势，其中超声解冻接近鲜肉水平，仅增加了0.9%，可能与超声波产生的空化效应导致团聚体破裂有关[70]。此外蛋白质平均粒径大小与其水合性密切相关，肌原纤维蛋白内部疏水残基暴露会促进肌原纤维蛋白的聚集，因此可联合内源荧光光谱的变化来判断解冻对肌原纤维蛋白聚集度的影响。Cao Minjie等[20]研究发现微波和远红外与磁性纳米材料结合解冻能抑制真鲷鱼肌原纤维蛋白聚集，可能是磁性纳米材料增加了蛋白热稳定性，降低了蛋白变性程度。综合来看，解冻过程中温度变化、物理振动以及氧化反应都对肌原纤维蛋白的聚集起着重要的作用。

4.2 解冻过程中肉品蛋白质降解程度的变化

蛋白质降解会导致其结构复杂化，即分子间形成二硫键、羰基化以及肽主链断裂等，而氨基酸侧链羰基化、分子间形成二硫键也是蛋白质发生氧化的标志[71]。由此可见，氧化是诱导蛋白质降解较为重要的因素。解冻过程会导致部分蛋白降解。目前，常通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析解冻过程中各分子质量蛋白质的降解程度，其降解程度可通过条带强度变化、有无条带消失以及新条带生成来判断。Xia Xiufang等[56]研究发现多次冻融循环会使猪肉肌球蛋白重链、副肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白的条带变淡、变窄。李银等[6]研究发现与新鲜牛肉相比，解冻会导致电泳图谱40 kDa蛋白条带消失并生成新的蛋白条带。而Cai Luyun等[19]也发现不同解冻方式会影响真鲷鱼肌球蛋白重链的条带。所以控制冻融循环次数以及选择合理的解冻方式来抑制蛋白质氧化是减缓蛋白降解程度的关键。已有研究表明肌原纤维蛋白的降解程度还与肌肉汁液流失密切相关，具体表现为不易流动水能随着蛋白质降解从肉品中渗出形成滴水[72-73]。因此，减缓蛋白质降解速率可提升肉品的保水性。也有研究认为蛋白质降解与肌肉组织内部内源酶被激活有关，解冻时肌纤维内肌浆网结构被大量破坏会导致Ca2+浓度增加，钙蛋白酶被激活，蛋白质降解程度增大[74]。

5 结 语

为改善传统的肉类解冻技术带来的耗时长、效率低下、品质恶化等缺点，新型解冻技术逐步应用在肉类食品中。微波、高压静电场、射频、超声波、远红外等技术可有效提高肉品解冻效率，却也有一定的局限性。综合比较新型解冻技术的优缺点，发现微波、超声波、远红外可与其他解冻技术或磁性材料联合解冻，既保留了新型解冻技术的高效性又解决了热分布不均、边缘熟化、成本高的问题，因此联合解冻技术在未来肉类工业中的应用具有巨大潜力，但其商业化应用仍需进一步加快，以期提高冷冻肉制品的品质。

解冻可使肉品保水性、色泽、新鲜度等发生变化，也会导致蛋白质氧化变性、结构改变和聚集特性变化。解冻会导致羰基、共价交联产生的二聚酪氨酸含量增高，巯基含量降低，疏水性氨基酸残基暴露，热稳定性变差，从而破坏蛋白质二级和三级结构，促进蛋白发生聚集或降解。今后，可以解冻技术对肉类蛋白质氧化、结构及聚集特性影响为着力点进行研究，阐明蛋白氧化与肉制品保水性的关联机制，以期寻求新型低耗、高效优质的解冻技术。