壳聚糖-单糖美拉德反应产物的制备及其在抗菌和抗氧化中的应用研究进展

邱婷婷，谭 啸，李若男，周丽莎，赵艳云，陈舜胜，张洪才,

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.国家淡水水产品加工技术研发分中心（上海），上海 201306；4.俄勒冈州立大学食品科技学院，美国 俄勒冈 科瓦利斯 97331-6602）

美拉德反应是指蛋白质的氨基与糖的羧基发生羰氨缩合反应[1]。而美拉德反应产物（Maillard reaction products，MRPs）除了具有提高食品香味、色泽及口感的作用外，还具有较强的抗菌、抗氧化作用[2-6]。美拉德反应广泛存在于食品加工、医疗、饮食等领域中，在加热条件下，葡萄糖-花生分离蛋白产生的MRPs可有助于提高花生分离蛋白饮料的水解度和消化率[7-10]。Yang Yuexi等[11]以大豆蛋白-多糖MRPs作为载体、保护剂和稳定乳化剂靶向递送柠檬醛或其他疏水化合物至动物或人的肠道。

目前国内外对蛋白质-壳聚糖美拉德反应的研究也较多，如β-乳球蛋白-壳聚糖、ε-聚赖氨酸-壳聚糖、大豆蛋白-壳聚糖之间发生美拉德反应，其MRPs可大大降低大肠杆菌的存活率[12-15]。壳聚糖因具有可食性、生物相容性、无毒、抗氧化性和抑菌性等优点，已广泛应用于食品、环境、医药和纺织等领域[16-17]。壳聚糖的氨基也可与单糖的羧基发生美拉德反应，使壳聚糖的生物活性（热稳定性）、抑菌、抗氧化等性能显著提高。李艳龙等[18]研究葡萄糖-壳聚糖在干热条件下易发生美拉德反应，它们的MRPs热稳定性与单一壳聚糖相比显著提高。鉴于国内外对单糖-壳聚糖之间MRPs深入研究鲜少，因此本文主要综述近年来壳聚糖-单糖（葡萄糖、果糖、木糖和阿拉伯糖等）MRPs的制备及其在抗氧化及抑菌方面的最新研究进展，为天然抗氧化剂及防腐保鲜剂的开发提供新的研究思路和理论基础。

1 壳聚糖-单糖MRPs的制备

壳聚糖的氨基在美拉德反应过程中被部分消耗，水溶性提高，赋予壳聚糖更好的生物活性。壳聚糖可与葡萄糖、果糖、木糖和阿拉伯糖等单糖发生美拉德反应，受到反应时间、反应温度、pH值、壳聚糖的分子质量、壳聚糖和单糖质量或体积比例等的影响（表1）。

表1 壳聚糖-单糖MRPs的制备条件Table 1 Preparation conditions for chitosan-monosaccharide MRPs

通常先将壳聚糖溶于乙酸溶液中，再加入一定质量比例的单糖于一定温度下共热制备壳聚糖-单糖MRPs，不同的反应条件会导致壳聚糖-单糖MRPs抗菌和抗氧化活性的差异。郭丽萍等[21]表明壳聚糖与葡萄糖质量比为1∶1、反应温度为120 ℃、pH 4.0、加热时间为2 h条件下产生的MRPs具有较强的抗氧化能力，相当于质量浓度0.5 mg/mL的VC溶液。Bakry等[28]在不同温度（80、100 ℃和120 ℃）下加热40 min制备壳聚糖-葡萄糖MRPs，结果表明热处理的MRPs的还原能力随着反应温度的升高而增大，120 ℃处理的MRPs具有较高的还原能力，相当于质量浓度4.28 mg/mL VC溶液。因此壳聚糖-单糖MRPs能够作为初级或二级天然抗氧化剂应用在食品工业等领域中。

Chang等[20]制备壳聚糖（1 g/100 mL）-葡萄糖（1、1.5 g/100 mL和2 g/100 mL）溶液，pH值调节至6.0，高压蒸汽处理（121 ℃、15 min）后冷却，结果表明不同质量体积比的壳聚糖-葡萄糖MRPs溶液对猪肉的抗氧化活性无显著差异，但都显著高于壳聚糖；新鲜猪肉样品在MRPs溶液中浸泡后，样品在贮藏过程中的微生物数量显著减少。因为壳聚糖-单糖MRPs主要带正电荷，能更有效地与细菌细胞表面的负电荷相互作用，破坏微生物膜的完整性，使微生物失活。Chien等[17]表明壳聚糖及其衍生物的Cu2+螯合能力随壳聚糖浓度的增加而增加，在样品质量分数为0.3%时螯合能力趋于饱和，其原因可能是来自糖类的氨基增多，有助于样品提高螯合能力。因此，壳聚糖经美拉德反应改性后，MRPs体外抗氧化及抗菌能力显著提高。壳聚糖MRPs的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、还原能力均随着葡萄糖和壳聚糖质量体积比例增加而增大，高温和较长的反应时间通常得到糖化程度更高及更多的褐色MRPs。

此外，也可通过物理辅助法延长美拉德反应的时间以及增强壳聚糖-单糖MRPs的生物活性。Nasrollahzadeh等[29]发现微波加热比通过常规加热获得的DPPH自由基清除能力更高，可能是由于微波下美拉德反应速率增加而导致高抗氧化活性产物的增加。此外，也可通过超声和辐射等辅助方法提高MRPs的生物活性，如Muppalla等[19]通过γ-辐射（0～100 kGy）壳聚糖-葡萄糖溶液，结果表明100 kGy剂量下形成的壳聚糖-葡萄糖MRPs的DPPH自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力分别为89%和70%，与未辐射的壳聚糖-葡萄糖MRPs相比，还原能力及对β-胡萝卜素保护作用显著提高，这可能是辐照后壳聚糖解聚过程中游离氨基暴露增加所致。

2 壳聚糖-单糖MRPs的抗氧化活性

基于不同的抗氧化机制来评估壳聚糖-单糖MRPs的抗氧化活性，包括金属离子螯合能力、还原能力、自由基清除能力和活性氧清除能力等。MRPs抗氧化活性的测定方法和反应机制见表2。

表2 MRPs氧化活性的测定方法和反应机制Table 2 Analytical methods for antioxidant activity of MRPs and reaction mechanisms

表3 壳聚糖-单糖MRPs的抗氧化和抗菌活性Table 3 Antioxidant and antibacterial activity of chitosanmonosaccharide MRPs

在不同种类的金属离子中，Fe2+具有最高的抗氧化作用，MRPs的金属螯合活性部分是由于黑色素的阴离子性质，使其成为过渡金属的螯合物[32-34]。MRPs的还原能力是由于壳聚糖的供氢能力破坏了自由基链并且提供了氢原子[35-36]。DPPH自由基相对稳定，常用来评价MRPs的抗氧化活性，它可与MRPs提供的氢原子结合形成稳定的DPPH·H分子，已被广泛用于测试化合物作为自由基清除剂或氢供体能力的抗氧化活性[37]。活性氧指具有比氧气分子活泼的氧的某些物质及其衍生物，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、H2O2等，活性氧清除已被广泛用作测定多种化合物抗氧化活性的标准方法[35]。

壳聚糖-单糖MRPs抗氧化和抗菌活性的测定如表3所示。

2.1 壳聚糖-葡萄糖MRPs的抗氧化活性

葡萄糖是自然界分布最广泛的单糖，它作为还原糖制备的壳聚糖-葡萄糖MRPs及抗氧化活性国内外报道较多。如Chang等[20]研究表明不同质量体积比例的壳聚糖-葡萄糖MRPs的DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原能力没有显著差异，但与壳聚糖本身相比，其抗氧化活性明显提高，其原因可能是络合物具有更好的自由基清除活性。徐红萍等[40]采用不同黏度的壳聚糖-葡萄糖混合溶液制备MRPs，结果表明低、中黏度壳聚糖-葡萄糖MRPs的铁离子螯合能力与壳聚糖相比分别提高了34.41%和24.5%。此外，壳聚糖-葡萄糖MRPs显著延长了4 ℃条件下草鱼肉片的货架期，经120 ℃处理的鱼片在冷藏期间的保质期为7 d[28]。壳聚糖-葡萄糖MRPs对草鱼鱼片的防腐作用可能是由于MRPs对鱼片中蛋白质、脂类和核苷酸氧化降解的产生的抗氧化能力以及MRPs中的黑色素、还原剂、呋喃和糠醛等抗菌成分的作用[28]。这些研究为保持肉类及水产品在冷藏过程中的鲜度和品质开拓新的思路。

Kanatt等[41]发现与人工抗氧化剂（丁基化羟基甲苯）相比，添加质量浓度150 μg/mL的壳聚糖-葡萄糖MRPs（强的供氢能力）可显著增强DPPH自由基清除能力。王军等[6]也表明壳聚糖-葡萄糖MRPs的吸光度、还原能力和亚铁螯合能力随着反应时间的延长而增加，在猪肉脯中添加一定量的MRPs能稳定猪肉脯在贮藏过程中的色泽、减少丙二醛的形成和提高氧化稳定性，这与壳聚糖MRPs的螯合能力及还原能力有关。

2.2 壳聚糖-果糖MRPs的抗氧化活性

果糖（己酮糖）是生活中常见的一种单糖，广泛存在于水果、蜂蜜和谷物等食物中，常在食品热加工及贮藏过程中与含氨基的化合物发生美拉德反应。因此，研究壳聚糖-果糖的MRPs的抗氧化活性具有重要的意义。如Zhang Hongcai等[24]采用高强度超声辅助水浴加热8 h制备壳聚糖-果糖MRPs，结果表明质量体积比例：1∶0.5、1.0 g/100 mL和1.5 g/100 mL壳聚糖-果糖MRPs的DPPH自由基清除能力分别为91.60%、87.10%和98.57%，而水浴加热MRPs的DPPH自由基清除能力分别为60.71%、71.58%和83.23%。此外，在相同的壳聚糖-果糖质量体积比例和反应时间下，超声波水浴加热制备的MRPs还原能力和氧自由基清除能力均显著高于水浴加热，这是因为超声的巨大压力、剪切力、湍流、动态搅拌和温度梯度等作用提高了壳聚糖的生物活性。此外，Ying Guoqing等[22]发现与N-烷基化壳聚糖衍生物相比，美拉德反应过程中产生的壳聚糖-果糖MRPs（Schiff碱型壳聚糖衍生物）具有较高的溶解性、酸碱稳定性和DPPH自由基清除能力（51.9%）。因此，通过美拉德反应制备的壳聚糖-果糖MRPs是一种具有广阔应用前景的工业产品。Zhang Hongcai等[42-43]还研究α-壳聚糖MRPs纳米粒子和β-壳聚糖MRPs纳米粒子的抗氧化活性，结果表明质量浓度0.1 mg/mL的α-壳聚糖（44.15 kDa）和β-壳聚糖（37.04 kDa）以及α-壳聚糖纳米粒子和β-壳聚糖纳米粒子的DPPH自由基清除能力分别为27.48%、36.56%、29.29%和24.04%。然而α-壳聚糖-果糖MRPs、β-壳聚糖-果糖MRPs、α-壳聚糖-果糖MRPs纳米粒子和β-壳聚糖-果糖MRPs纳米粒子的DPPH自由基清除能力分别高达75.48%、68.07%、89.76%和92.44%。

壳聚糖-果糖MRPs的抗氧化能力与浓度有关，浓度越高，其DPPH自由基清除能力越强。壳聚糖-果糖MRPs的抗氧化活性主要与聚合物链中的活性羟基和氨基含量有关，物理辅助方法可提高壳聚糖氨基与果糖的反应速率，从而提高壳聚糖-果糖MRPs的抗氧化活性。此外，低分子质量的壳聚糖由于分子间和分子内氢键被破坏，氨基的裸露也可增强壳聚糖-果糖MRPs的抗氧化活性。

2.3 壳聚糖-木糖MRPs的抗氧化活性

木质半纤维素水解制备的木糖（戊醛糖），是产量仅次于葡萄糖的单糖，在食品领域得到广泛应用[44-45]。木糖也可与壳聚糖发生美拉德反应，以提高壳聚糖的溶解度及抗氧化等生物活性。如Zhu Kexue等[26]以壳聚糖和木糖为原料，研究MRPs的抗氧化抑暗活性（抑制美拉德反应、避免产物颜色加深）对半干面保藏品质的影响，结果表明与壳聚糖相比，壳聚糖-木糖MRPs的DPPH自由基清除能力（60%）、铜离子螯合能力（69%）、多酚氧化酶抑制活性及还原能力显著增强。壳聚糖-木糖MRPs可作为一种新型的半干面保鲜剂，能有效地抑制面条变黑，可以抑制面条的质地和烹饪品质降低，这是由于壳聚糖-木糖MRPs对多酚氧化酶活性的强抑制作用。Li Xiaoxia等[27]制备壳聚糖-木糖MRPs，结果表明加热180 min后，MRPs的DPPH自由基清除能力高达95%，显著高于壳聚糖（20%）和木糖（18%），同时也能抑制脂质过氧化。

尽管壳聚糖-单糖美拉德反应的原理类似，但与葡萄糖和果糖相比，壳聚糖-木糖美拉德反应体系国内外报道较少，后续研究应主要侧重于如何提高壳聚糖-木糖MRPs的反应速率以及反应过程中间体的分离和活性测定等方面。

2.4 壳聚糖-其他单糖MRPs的抗氧化活性

除葡萄糖、果糖、木糖等单糖可与壳聚糖发生美拉德反应制备MRPs，阿拉伯糖也可作为羰基供体与壳聚糖发生美拉德反应。周向军等[25]分别研究壳聚糖-阿拉伯糖MRPs和壳聚糖-果糖MRPs对DPPH自由基、羟自由基、H2O2的清除能力，结果表明壳聚糖-阿拉伯糖MRPs的DPPH自由基清除能力（94%）、羟自由基清除能力（77%）、H2O2清除能力（58%）均高于壳聚糖-果糖MRPs（分别为92%、65%和53%）。因此，壳聚糖-阿拉伯糖可为天然抗氧化剂的开发提供新的思路。

总之，与壳聚糖相比，壳聚糖可与葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖和木聚糖等糖类相互作用产生MRPs，通过形成还原酮、自由基清除和金属螯合等机制表现出较高的抗氧化能力。因此，壳聚糖-单糖MRPs是一种应用前景较好的抗氧化剂。抗氧化性能不仅取决于抗氧化物质，还取决于食品体系之间的相互作用。由于美拉德反应过程中间产物较多，反应体系较为复杂，后续的研究应侧重于单一因素调控，制备美拉德反应中间产物，研究MRPs的抗氧化和重金属螯合机制。壳聚糖-单糖MRPs不仅可以应用于食品加工和保鲜等领域中，在医药和环境方面的应用也有待于进一步挖掘。

3 壳聚糖-单糖MRPs的抗菌活性

壳聚糖的氨基可在微酸性溶液中电离，引起带有正电荷的壳聚糖与细胞膜上带负电荷的物质相互作用以破坏膜的通透性，导致细胞内容物释放和细菌死亡[46-48]。壳聚糖的抗菌机制主要体现在以下两个方面：1）细胞表面磷脂双分子层破裂而导致细胞内容物的泄漏，细胞膜内外的渗透压不平衡而导致细菌死亡；2）细胞内关键酶，如呼吸酶受到抑制，而引起酶的二级和三级结构发生改变，并导致DNA的转录和翻译受阻，细胞自身的新陈代谢停止[49-51]。此外，壳聚糖的抑菌特性受多种因素（脱乙酰程度、分子质量、微生物种类、离子强度和pH值等）的影响[52]。廖爱琳等[53]研究壳聚糖浓度对金黄色葡萄球菌抗菌活性的影响，结果表明壳聚糖浓度的升高导致反应体系中阳离子氨基（NH3+）的浓度升高，从而起到较强的抗菌作用。

与壳聚糖相比，壳聚糖-葡萄糖MRPs有较高的抗氧化和抗菌活性，如壳聚糖-木糖MRPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有着较高的抗菌活性[54-55]（表3）。

3.1 壳聚糖-葡萄糖MRPs的抗菌活性

热处理制备的壳聚糖-葡萄糖MRPs已被证明可以改善各种肉制品的品质。如Chang等[20]研究壳聚糖-葡萄糖MRPs对贮藏期猪肉感官的影响，结果表明与空白对照组（未经任何浸渍处理的样品）相比，MRPs能显著降低挥发性盐基氮和硫代巴比妥酸反应性物质的含量，猪肉样品菌落总数也显著降低，贮藏7 d后，壳聚糖-葡萄糖MRPs处理的样品嗜冷菌数量显著低于空白对照组样品。经γ-辐射（0～100 kGy）制备的壳聚糖-葡萄糖MRPs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌分别减少5、3（lg（CFU/mL））和1（lg（CFU/mL））[19]（表3）。因此，壳聚糖-葡萄糖MRPs能够抑制新鲜猪肉样品在冷藏过程中微生物的生长。除了应用于肉制品之外，壳聚糖-葡萄糖MRPs也可应用于水产品的抗菌保鲜。Sun Tao等[38]研究比较壳聚糖-寡糖MRPs和壳聚糖-麦芽糖MRPs的抗菌活性，结果表明壳聚糖-寡糖MRPs抗菌活性较强，与对照组（无菌水）相比，菌落总数减少约3.5（lg（CFU/mL）），此外，壳聚糖-寡糖MRPs和壳聚糖-麦芽糖MRPs处理的虾肉表现出较高的质量和较低的腐败率，这可能与MRPs的抗菌和抗氧化活性有关。

3.2 壳聚糖-果糖MRPs的抗菌活性

壳聚糖-果糖MRPs也具有良好的抗菌活性，如Zhang Hongcai等[24]研究超声辅助水浴加热制备不同壳聚糖-果糖质量体积比例的MRPs，其对金黄色葡萄球菌和和大肠杆菌的MIC分别为2 500 mg/L和313～625 mg/L（表3），均显著高于壳聚糖，但与单纯水浴加热制备的MRPs相比无显著性差异，主要是因为壳聚糖-果糖MRPs水溶性增加，抗菌活性增强。董志俭等[23]采用圆滤纸片（直径6 mm）法研究壳聚糖-果糖MRPs的抑菌活性，当壳聚糖与果糖质量比为2∶1时，抑菌性最强，壳聚糖-果糖MRPs对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为9 mm（对照组壳聚糖抑菌圈直径为8.5 mm）；当反应温度为121 ℃和pH 4.0时，壳聚糖-果糖MRPs抑菌性最强（抑菌圈直径10 mm）（表3）。壳聚糖-果糖M R P s 的抑菌能力随p H 值（＜5.5）的增加呈现出先增大后减小的趋势，这是因为高温和低pH值有利于美拉德反应进行，从而提高MRPs抑菌能力，但pH＞4.0后，壳聚糖的溶解性和质子化程度降低，故抗菌能力逐渐减弱。

3.3 壳聚糖-木糖MRPs的抗菌活性

壳聚糖-木糖MRPs的抗菌性能近年来的研究较多，壳聚糖-木糖的美拉德反应进一步增强了壳聚糖的抗菌活性，如Huang Jinru等[39]研究壳聚糖-木糖MRPs在95 ℃、pH 6.0和加热10 h的反应体系下对新鲜面条货架期的影响，结果表明添加0.05 g/100 mL壳聚糖和壳聚糖-木糖MRPs的新鲜面条货架期分别延长6 d和14 d。在相同贮藏条件下，对照组（不含任何防腐剂）和添加0.35 g/100 mL壳聚糖-木糖MRPs的半干面条的菌落总数分别在6 d和13 d后达到106CFU/g（初期变质程度），因此壳聚糖-木糖MRPs对延长半干面的货架期更有效[26]。Li Xiaoxia等[27]表明壳聚糖-木聚糖MRPs可延长新鲜猪肉的货架期，对照组（未经任何浸渍处理的样品）在贮藏9 d后，新鲜猪肉的菌落总数大于107CFU/g，而壳聚糖和MRPs处理组的猪肉在20 d贮藏期内仍可食用。因此，壳聚糖-木糖的美拉德反应是一种制备新型防腐剂的有效途径。前期研究表明向用美拉德反应改性的壳聚糖制成膜中加入壳寡糖，由于增强了壳聚糖的功能活性基团，膜的溶解度降低，抗菌活性也会增强，然而壳寡糖-单糖膜的生物活性还需进一步研究[56]。

与壳聚糖相比，壳聚糖-单糖（葡萄糖、果糖和木糖等）MRPs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特增生菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌等都有较强的抗菌能力，但抗菌机制还不明确，国内外主要是以壳聚糖的抗菌机制分析MRPs的抗菌能力，对壳聚糖MRPs的抗菌机理还有待深入研究。

4 结 语

与壳聚糖和单糖相比，壳聚糖-单糖MRPs不仅使DPPH自由基清除能力、H2O2清除能力、还原能力及抑菌能力显著增强，还具有很强的重金属螯合能力和多酚氧化酶抑制能力，可防止果蔬褐变，抑制果蔬、脂类食品、肉制品和水产品的氧化腐败以延长食品货架期。同时壳聚糖-葡萄糖MRPs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和蜡样芽孢杆菌具有较强的抗菌活性，可用于延长猪肉、面条和鲜切果蔬的货架期。壳聚糖-单糖MRPs在食品领域中具有较大的应用价值，但目前壳聚糖-单糖MRPs的商业应用有限，结合现状可从以下两个方面进行深入研究：1）确定最佳单糖和反应条件。目前的壳聚糖-单糖MRPs研究大都集中于某一种单糖与壳聚糖MRPs的抗菌、抗氧化，而非多种单糖与壳聚糖MRPs的比较，后续研究可重点关注制备壳聚糖-单糖MRPs的最适单糖及美拉德反应的最佳反应条件。此外，在食品生产应用过程中，可采取物理辅助的方法提高美拉德反应的反应速率和MRPs的生物学活性。2）深入研究壳聚糖-单糖MRPs抗氧化和抑菌机制。MRPs种类复杂，目前实验结果较多通过壳聚糖来解释壳聚糖-单糖MRPs的抗氧化和抗菌机制，对壳聚糖-单糖MRPs抗菌和抗氧化的具体成分及机制仍需进一步研究。