钙敏感受体参与高糖诱导的内皮细胞内质网应激的作用研究

宋振蓉，刘晓玲，陈 敏，李 洁，高雪梅，张轩萍

(1.山西医科大学药理学教研室，山西 太原 030001；2.山西卫生健康职业学院生理学教研室，山西 晋中 030619)

高血糖是糖尿病的主要病理特征，会引起一系列心血管并发症，病变涉及心肌细胞和血管内皮细胞等[1]。内皮细胞位于血管壁内层，直接暴露于血管中的各种刺激，高血糖会导致血管内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，最终引发动脉粥样硬化等糖尿病心血管并发症[1]。而细胞内钙浓度的变化，是引发ERS的起始因素之一[2]，进一步导致内皮细胞受损。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族第Ⅱ组成员，对细胞内Ca2+浓度有重要的调节作用[3]。本研究旨在探讨高糖所致的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤中，CaSR与细胞损伤和内质网应激之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(CL-0122, 武汉普诺赛生命科技有限公司)；

1.1.2药品与试剂 GdCl3(G7532, Sigma-Aldrich)；NPS-2390(11989-5, Cayman Chemical)；DMEM低糖培养基(SH30021.01)、DMEM高糖培养基(SH30022.01)(HyClone)；细胞活力及毒性CCK-8检测试剂盒(AR1160)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(AR1189)(武汉博士德生物工程有限公司)；活性氧检测试剂盒(S0033S)、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(C0016)、一氧化氮检测试剂盒(S0021)、Fluo-4 AM钙离子荧光探针(S1060)(上海碧云天生物技术有限公司)；MDA测定试剂盒(A003-2-2)(南京建成生物工程研究所)；抗CaSR(sc-47741)、抗PERK(sc-377400)(Santa Cruz)；抗p-PERK(3179, Cell Signaling Technology)，抗GRP78(ab21685)、抗IRE1α(ab37073)、抗p-IRE1α(ab48187)、抗ATF6(ab135707)、抗β-actin(ab8226)(Abcam)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL超敏发光液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3实验仪器 BB150-2TCS CO2细胞培养箱、高速冷冻离心机、超低温冰箱(Thermo Fisher Scientific)；倒置生物显微镜(AE2000, 麦克奥迪实业集团有限公司)；低速离心机(SC-04, 中科中佳科学仪器有限公司)；灭菌器(GI54TW, 南京庚辰科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(CS101-2EBN, 重庆华茂仪器有限公司)；细胞超净工作台(ZHJH-C1112B, 上海智诚仪器有限公司)；全自动酶标仪(SMATB, BioTek)；小型垂直电泳仪、电泳电源、半干转膜仪、ChemiDoc XRS凝胶成像系统(Bio-rad)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组 在37 ℃、5% CO2的培养箱内用含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1链霉素的DMEM培养基培养HUVEC细胞，每2～3 d换液，待细胞贴壁达80%～90%时，可进行传代。

将细胞以无血清低糖DMEM饥饿12 h后，按以下实验分组干预72 h：①正常糖对照组(NG, 5.5 mmol·L-1Glu)；②高糖组(HG, 25 mmol·L-1Glu)；③正常糖+CaSR激动剂GdCl3组(NG+GdCl3, 5.5 mmol·L-1Glu+300 μmol·L-1GdCl3)；④高糖+CaSR拮抗剂NPS-2390组(HG+NPS-2390, 25 mmol·L-1Glu+10 μmol·L-1NPS-2390)。

1.2.2细胞损伤与毒性的检测 采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液(约为5×103个细胞)，待细胞完全贴壁后饥饿12 h，随后按分组干预72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育2 h后，在酶标仪上测定450 nm处的吸光度值。

采用乳酸脱氢酶(lactate dehydro genase，LDH)试剂盒检测培养液上清LDH含量，到预定时间前1 h时，在设定的样品最大酶活性孔中加入20 μL LDH释放剂，吹打混匀放回培养箱继续培养。1 h后取出培养板，离心并吸取上清120 μL，按说明书进行后续操作，测定490 nm处吸光度。

采用NO试剂盒检测培养液上清中NO的含量，每孔取50 μL细胞培养液上清，并向其中迅速加入Griess Reagent Ⅰ 、Griess Reagent Ⅱ 液各50 μL，混匀，在酶标仪上测定540 nm处的吸光度。

1.2.3细胞氧化应激的检测 采用活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒测定细胞内ROS的含量，干预结束后吸去培养基，用PBS清洗两遍，加入含有10 μmol·L-1DCFH-DA活性氧探针的无血清培养液，在培养箱中继续孵育20 min。用无血清培养液轻柔地洗两次，以激发波长 488 nm，发射波长525 nm 在酶标仪上进行检测。

采用MDA测定试剂盒检测细胞脂质氧化水平，干预结束后吸去培养基，用PBS清洗两遍，加入150 μL裂解液，冰上裂解30 min后10 000×g离心15 min，取上清。一部分细胞裂解液用BCA法测定蛋白浓度，其余按照说明书进行MDA含量的检测。

1.2.4细胞内钙离子浓度的检测 采用Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测细胞内钙离子浓度，用含有2 μmol·L-1Fluo-4 AM的无血清培养液在培养箱中孵育40 min，随后用无血清培养液轻柔地洗两次，再孵育20 min。以激发波长488 nm，发射波长为516 nm在酶标仪上检测。

1.2.5Western blot检测相关蛋白的表达 收集细胞，加入裂解液后冰上裂解30 min，13 000 rpm 15 min离心取上清，BCA 法测蛋白浓度。蛋白定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入相应抗体，抗CaSR(1 ∶ 1 000)、抗GRP78(1 ∶ 1 000)、抗PERK(1 ∶ 500)、抗p-PERK(1 ∶ 1 000)、抗IRE1α(1 ∶ 1 000)、抗p-IRE1α(1 ∶ 1 000)、抗ATF6(1 ∶ 1 000)、抗β-actin(1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜后加入相应的二抗(1 ∶ 5 000)，在室温孵育1 h。利用凝胶成像系统曝光，使用 Image Lab 软件对图像进行灰度值分析。

2 结果

2.1 高糖及CaSR导致HUVEC细胞的损伤情况与NG组相比，HG组和NG+GdCl3组细胞存活率明显降低至(72.47±4.16)%和(71.94±4.68)%(P<0.01)；LDH漏出率明显增高，为(28.71±5.40)%和(25.00±5.35)%(P<0.01)；培养液上清NO含量减少，是(9.09±0.49)μmol·L-1和(9.44±0.72)μmol·L-1(P<0.01，P<0.05)。说明高糖和CaSR激活会造成内皮细胞损伤。与HG组相比，HG+NPS-2390组细胞存活率增高(82.17±4.65)%(P<0.01)；LDH漏出率明显降低，为(17.06±1.80)%(P<0.01)；培养液上清NO含量明显升高(10.97±0.50)μmol·L-1(P<0.01)(Fig 1)。在高糖状态下，CaSR阻断剂NPS-2390可以改善内皮细胞损伤，表明CaSR可能参与了高糖诱导的内皮损伤。

Fig 1 High glucose and CaSR activation

2.2 高糖对HUVEC细胞钙离子浓度和CaSR蛋白表达的影响与NG组相比，HG组HUVEC细胞内钙离子浓度明显升高(313.3±30.66)(P<0.01)， HG组CaSR蛋白表达增多(0.47±0.11)(P<0.01)(Fig 2)。高糖使HUVEC细胞内钙离子浓度升高，CaSR表达增多，说明钙敏感受体与高糖诱导HUVEC损伤有关。

Fig 2 Effect of different sugar levels on intracellular Ca2+concentration and CaSR expression in n=6)

2.3 高糖及CaSR对HUVEC细胞氧化应激的影响与NG组相比，高糖和CaSR激动剂GdCl3使HUVEC细胞ROS水平和MDA含量明显增加(P<0.01)，高糖刺激或钙敏感受体的激活，会使内皮细胞发生氧化应激。与HG组相比，钙敏感受体抑制剂NPS-2390使HUVEC细胞内ROS水平和MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)(Fig 3)，表明在高糖状态下使用CaSR抑制剂，可以减轻HUVEC的氧化应激，说明抑制钙敏感受体可以减轻高糖诱导的氧化应激。

2.4 高糖及CaSR对HUVEC细胞内质网应激的影响与NG组相比，高糖孵育和CaSR激动剂GdCl3导致HUVEC细胞GRP78、p-PERK、p-IRE1α蛋白表达水平增高(P<0.05)，发生了ERS。与HG组相比，CaSR抑制剂NPS-2390处理后，除ATF6的表达无明显改变，其他所检测的ERS标志蛋白的表达均下降(P<0.05)(Fig 4)。表明抑制CaSR可减轻高糖诱导的HUVEC内质网应激。

Fig 3 High glucose and CaSR activation induced oxidative stress in n=6)

Fig 4 Expression of ERS marker protein during high glucose and CaSR n=6)

3 讨论

心血管疾病是糖尿病严重的并发症之一，高血糖是动脉粥样硬化早期的重要风险因素[4]。前期在患者、动物和细胞水平的研究表明，高血糖导致的动脉粥样硬化斑块的形成，与内皮细胞功能障碍有关[5-6]，其中涉及的机制包括氧化应激[7]、炎症[8]、内质网应激[9]等，本实验采用HUVEC为实验对象，因其功能与血管内皮细胞相似，故被广泛用作研究内皮细胞功能的模型[10]。我们的实验结果表明，与NG组(5 mmol·L-1)相比，HG组(25 mmol·L-1)HUVEC细胞高糖孵育72 h后细胞活力下降，LDH漏出增多，细胞NO生成减少，氧化应激反应增强，内皮细胞出现明显损伤，与先前研究结果一致[11]。同时，HG组细胞内Ca2+浓度升高，CaSR表达增多。HG组细胞GRP78、p-PERK、p-IRE1α表达增多，HUVEC发生内质网应激。说明高糖会诱导HUVEC细胞损伤、增加CaSR活性、使细胞发生内质网应激。

钙稳态对于心血管功能有重要意义，钙敏感受体属于GPCRs，首先被发现于甲状旁腺中[12]，内皮细胞中同样有CaSR蛋白表达，其参与钙稳态的调节[13]。正常糖浓度下，给予细胞GdCl3(CaSR激动剂)后细胞损伤明显，说明钙敏感受体参与了细胞损伤。以25 mmol·L-1高糖刺激72 h，建立高糖诱导的HUVEC损伤模型，给予NSP-2390(CaSR抑制剂)后细胞存活率明显提高，细胞损伤明显减轻。这些结果表明，正常情况下CaSR激活会导致HUVEC细胞损伤，说明CaSR参与了细胞损伤。高糖状态下，抑制CaSR对HUVEC有保护作用。

而内质网是参与膜蛋白的合成、结合蛋白的分泌、钙稳态和脂质生物合成的一个细胞器[9]，由于参与折叠反应的许多伴侣是Ca2+结合蛋白，其中一些过程，如二硫键的形成，依赖于氧化还原，因此内质网腔的特点是高Ca2+浓度和特殊的氧化还原环境[14]。当存在各种刺激时，如Ca2+稳态失衡，会导致未折叠和错误折叠的蛋白质在内质网腔内聚积，发生未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，过度的UPR会引发内质网应激[15]。研究表明，CaSR介导的信号通路会对细胞外危险信号，如ATP或Ca2+做出反应，激活磷脂酶(phospholipase C)，诱导三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate)与其受体作用后从内质网释放Ca2+到细胞内，而内质网出现钙剥夺，最终发生ERS[16-17]。但鲜有研究涉及高糖、CaSR和内质网应激之间是否存在联系。我们在使用CaSR激动剂与抑制剂后检测标志性蛋白以观察ERS的发生。与NG组相比，NG+GdCl3组细胞损伤明显，GRP78、p-PERK 、p-IRE1α蛋白表达增多，另一标志性蛋白ATF6无明显改变。与HG组相比，HG+NSP-2390组细胞损伤减轻，内质网应激标志蛋白表达下降，内质网应激减轻。说明CaSR参与了高糖造成的HUVEC损伤。可能是高糖通过多种机制使胞外Ca2+内流，激活CaSR，使内质网腔钙紊乱，发生ERS，导致内皮细胞损伤。抑制CaSR能够使细胞损伤和内质网应激减轻。由此推测，CaSR和ERS在糖尿病相关内皮功能障碍中有重要作用，但其中具体的分子机制尚不明确，有待进一步研究。

综上所述，高糖会造成内皮细胞损伤，伴有细胞内钙离子浓度增高，CaSR表达增多。且高糖使HUVEC中内质网应激标志性蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α表达增多，抑制CaSR可以减轻HUVEC内质网应激和细胞损伤，说明CaSR可能参与了高糖状态下内皮细胞内质网应激造成的细胞功能障碍。因此，CaSR有望成为糖尿病心血管并发症的药物研发新靶点。