七氟烷预处理和miR-29b-3p对大鼠脊髓缺血/再灌注损伤的影响

马克军，方 波，陈凤收，李 哲，贾 慧，马 虹

(中国医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 沈阳 110001)

在胸、腹主动脉瘤等大血管手术中，时常发生脊髓缺血/再灌注损伤(spinal cord ischemia/reperfusion injury，SCIRI)，严重影响患者预后和生活质量，目前临床上仍然缺乏足够有效预防和治疗SCIRI的方法[1-2]。微小RNA(microRNA，miRs)通过拮抗mRNA的翻译来调控蛋白质的表达，是正常神经系统发育，功能和疾病的有效调节剂[3-6]。miR-29在脑稳态中起到广泛而关键的作用，miR-29a和miR-29b的丢失可以导致脑神经元死亡[3, 7]。BCL-2蛋白修饰因子(BCL-2 modifying factor，BMF)可能为miR-29b-3p的特异性靶标，TargetScan (http：//www.targetscan.org/vert_72/)预测结果显示，miR-29b-3p和BMF mRNA的3′ UTR有8个连续互补的核苷酸。七氟烷(sevoflurane，Sevo)是目前临床应用最为广泛的吸入性麻醉药，对心、脑、脊髓等器官的缺氧性损伤具有保护作用[4, 8-10]。七氟烷可以影响脏器中多种miRs的表达[9-11]。那么，七氟烷是否可以影响miR-29b-3p的表达？miR-29b-3p是否可以改变凋亡相关因子BMF的表达，进而减轻脊髓缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，IR)损伤？因此，本研究拟探讨七氟烷预处理和miR-29b-3p对大鼠SCIRI的影响及其可能调控机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择与分组SPF级健康♂Sprague-Dawley大鼠，8周龄，体质量(250～280) g，由中国医科大学实验动物中心提供。动物合格证和使用许可证号分别为：SCXK(辽)013-0001、SYXK(辽) 013-0007。该研究得到中国医科大学伦理委员会的批准(IACUC第2019226号)，并符合美国国立卫生研究院动物护理和使用指南。75只大鼠，随机分为5组(n=15)：假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(IR组)、IR+七氟烷预处理组(IR+Sevo组)、IR+同步转染作为对照的错义寡核苷酸组(IR+NC组)、IR+miR-29b-3p过表达组(IR+mimic组)。Sham组只暴露但不夹闭主动脉弓。通过夹闭主动脉弓14 min，建立大鼠SCIRI模型。IR前将大鼠暴露于2.4%(1 Mac)七氟烷中并持续1 h，建立七氟烷预处理模型。在SCIRI模型手术前，IR+mimic组和IR+NC组，每24 h鞘内注射一次miR-29b-3p mimic或同步转染作为对照的错义寡核苷酸，共3次。于IR后36 h时，对大鼠实施安乐死，断头取髓(L4-6)。

1.2 SCIRI模型如前所述建立SCIRI模型[1, 4, 6, 9]。简而言之，戊巴比妥钠(50 mg·kg-1，腹腔内注射，Beyotime，中国)麻醉后，气管切开，行气管插管后连R407小动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国)进行机械通气。取大鼠左侧卧位，于第一肋间隙暴露主动脉弓。假手术组仅暴露主动脉弓而不夹闭。通过在左颈总动脉和左锁骨下动脉之间夹闭主动脉弓14 min，诱发脊髓缺血。然后松开血管夹，恢复灌注。之后下胸腔闭式引流，逐层缝合伤口，密切监测大鼠生命指征。待大鼠恢复自主呼吸后，拔除气管导管。

1.3 七氟烷预处理模型将大鼠放入自制密闭箱，连接麻醉机，保留自主呼吸，七氟烷预处理组吸入33%的氧气+2.4%(1 MAC)的七氟烷(丸石制药株式会社,日本)，其他组吸入33%的氧气，持续1小时，待洗脱七氟烷30 min后，对大鼠进行SCIRI模型手术[6, 9]。

1.4 鞘内注射将miR-29b-3p mimic(GenePharma，中国)或用作对照的错义寡核苷酸(GenePharma，中国)与Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific，美国)转染试剂按100 μmol·L-1浓度混合。使用25 μL微量注射器(高鸽，中国)，将混合液缓慢注射到大鼠蛛网膜下腔。当大鼠有明显的甩尾动作时，表示针尖正确定位到蛛网膜下腔(L4-5)。在SCIRI手术前3 d，每24 h向IR+mimic组和IR+NC组大鼠鞘内注射15 μL相应的混合液，共3次。相关序列如下：miR-29b-3p MIMAT0000801：5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；miR-29b-3p control：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.5 大鼠后肢运动功能评估对实验不知情的两名观察者，在大鼠安乐死前，使用Tarlov评分，对大鼠后肢运动功能进行评分，其中0分为大鼠无下肢功能，4分为正常的运动功能[6]。

1.6 伊文思蓝(Evans blue，EB)染色采用伊文思蓝染色检测血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)的完整性和通透性[1, 9]。简而言之，在安乐死前1 h，通过大鼠尾静脉，缓慢注入2%EB(45 mg·kg-1；Beyotime，中国)。使用冰冻切片机(Leica Microsystems，德国)在-20 ℃时将脊髓组织(L4-6)切成6 μm的冰冻切片。通过荧光显微镜(Leica，德国)观察并采取图像，使用Image Pro-Plus软件计算EB的荧光强度。

1.7 Hematoxylin-eosin(HE)染色观察脊髓细胞形态将3 μm的脊髓石蜡切片用于HE(Beyotime，中国)染色[5]。通过显微镜(Leica，德国)观察脊髓细胞形态并采取图像，计算脊髓灰质前角健存神经元数量。

1.8 TUNEL检测脊髓细胞凋亡程度按照说明书，使用TUNEL凋亡试剂盒(Beyotime，中国)对3 μm的脊髓石蜡切片进行染色[5, 9]。通过显微镜(Leica，德国)观察并采取图像。使用Image-ProPlus图像分析软件，计算脊髓前角TUNEL阳性细胞数，以确定细胞凋亡率。

1.9 Real-time qPCR使用TaKaRa RNA提取试剂盒(TaKaRa，日本)提取脊髓组织(L4-6)中的总RNA。按照说明书，将总RNA反转录为qRT-PCR的模板。通过Prism 7500检测系统(Applied Biosystems，美国)检测特异性PCR产物。所使用的引物(生工生物工程上海股份有限公司，中国)如下：GAPDH (forward, 5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCCCTG-3′;reverse, 5′-AGGCGTCCGATACGGCCAAA-3′), BMF (forward, 5′-CAACGCTGGCTACAGGCTTCC-3′; reverse, 5′-CTGCTCGGTGCTGAAGGAACTG-3′), U6 (forward： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′), miR-29b-3p (forward, 5′-CGGGTAGCACCATTTGAAATCAGTGTT-3′)。

1.10 Western blot如前所述提取大鼠脊髓(L4-6)中的总蛋白并进行蛋白质印迹[6]。对蛋白质(60 μg)进行SDS-PAGE凝胶(凯基生物，中国)电泳。使用的主要抗体如下：兔抗BMF(1 ∶ 500; Abcam，英国)，兔抗Bax(1 ∶ 1 000; Cell Signaling Technology，CST，美国)，兔抗cleaved caspase-3(1 ∶ 1 000; CST，美国)和小鼠抗β-actin(1 ∶ 4 000； ZSGB-BIO，中国)，次日孵育相应的二抗(1 ∶ 10 000； ZSGB-BIO，中国)。使用增强的化学发光(ECL Advance Kit；Bio-Rad Laboratories，意大利)和Image Lab软件，使PVDF膜上的蛋白可视化。采用ImageJ软件对蛋白进行定量分析。

2 结果

2.1 大鼠后肢运动功能变化与Sham组相比，IR组Tarlov评分较低(P<0.05，Fig 1)。与IR组相比，IR+Sevo组和IR+mimic组的Tarlov评分明显升高(P<0.05，Fig 1)，IR+NC组未见差别。

2.2 七氟烷和miR-29b-3p对BSCB通透性的影响Sham组几乎未见红色荧光，IR组呈鲜红色荧光(P<0.05，Fig 2)。与IR组相比，IR+Sevo组和IR+mimic组的红色荧光明显减弱(P<0.05，Fig 2)，IR+NC组未见差别。

2.3 七氟烷和miR-29b-3p对脊髓神经元形态的影响与Sham组相比，IR组可见神经元数目减少(P<0.05，Fig 3)；与IR组比较，IR+Sevo组和IR+mimic组的脊髓细胞结构相对完整，脊髓组织损伤减轻，组织病理学改变较为接近正常组织(P<0.05，Fig 3)。

Fig 1 Tarlov scores 36 h after

Fig 2 Permeability of BSCB 36 h after

2.4 七氟烷和miR-29b-3p对脊髓细胞凋亡的影响在显微镜下可以看到，Sham组脊髓组织神经元结构较完整且圆润，细胞核清晰可见，细胞质均匀一致；IR后，神经元胞核较大或缺失，可见核固缩，深染。与Sham组相比，IR组脊髓细胞凋亡率明显增加(P<0.05，Fig 4)。与IR组相比，七氟烷预处理或者过表达miR-29b-3p能够明显改善脊髓IR后的凋亡情况(P<0.05，Fig 4)，IR+NC组未见差别。

2.5 七氟烷预处理对脊髓组织中miR-29b-3p表达的影响与Sham组相比，IR组miR-29b-3p表达明显降低(P<0.05，Fig 5)。与IR组相比，七氟烷预处理或者过表达miR-29b-3p能够明显增加miR-29b-3p的表达水平(P<0.05，Fig 5)，IR+NC组未见差别。

Fig 3 Morphology of spinal cord motor neurons

Fig 4 Apoptotic rate 36 h after SCIRI by

Fig 5 miR-29b-3p expression 36 h after

2.6 七氟烷预处理对脊髓组织中BMF mRNA表达的影响与Sham组相比，IR组BMF mRNA表达水平明显增加(P<0.05，Fig 6)。与IR组相比，IR+Sevo组和IR+mimic组的BMF mRNA表达降低(P<0.05，Fig 6)，IR+NC组未见差别。

Fig 6 BMF mRNA expression 36 h after

2.7 七氟烷对脊髓组织中BMF、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达的影响与Sham组相比，IR组凋亡相关蛋白BMF、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05，Fig 7)。与IR组相比，IR+Sevo组和IR+mimic组的BMF、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达降低(P<0.05，Fig 7)，IR+NC组未见差别。

3 讨论

脊髓缺血/再灌注损伤严重影响患者的预后和生活质量。在临床上，一些预防SCIRI的方法，例如减少主动脉钳夹和置换时间，低体温和辅助药物等，起到了一定效果，但是仍然缺乏足够有效的治疗方法[1, 9]。因此，迫切需要进一步的研究探索SCIRI的发生发展机制并制定更有效的治疗策略。

Fig 7 Protein expression of BMF, Bax and caspase 3

在本研究中，IR大鼠出现了严重后肢运动功能障碍，证明SCIRI造模成功。我们观察到IR大鼠脊髓中miR-29b-3p的表达严重失调，Fig 5显示IR组miR-29b-3p的表达明显受到抑制。与本研究相似，在多个缺血模型中观察到miRs表达失调，例如miR-199a-5p、miR-125b和miR-122a等[5-6]。

在大鼠脊髓中，BMF为miR-29b-3p的特异性靶标。miRs可以在转录后水平，特异性沉默靶标mRNA表达[3-6]。TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)显示，miR-29b-3p和BMF mRNA的3′ UTR有超过6个连续互补的核苷酸。miRNA-mRNA的结合位点在物种之间通常是保守的。在小鼠脂多糖刺激模型中，miR-29b可以靶向沉默BMF提高破骨细胞存活率[12]。在本研究中，IR+Sevo组或IR+mimic组脊髓中miR-29b-3p的表达水平升高(Fig 5)，与之相反的是BMF mRNA和蛋白表达水平降低(Fig 6，7)。脊髓中升高的miR-29b-3p可以明显抑制BMF的表达，进一步证明了在大鼠脊髓中，miR-29b-3p可以靶向调控BMF。并且BMF在神经元凋亡中起着重要作用，下调或敲低BMF表达有助于减轻神经元凋亡[13]。

上调miR-29b-3p可以明显减轻大鼠SCIRI后的凋亡反应。这与之前的研究结果相似，例如上调miR-199a-5p和miR-125b或者下调miR-122a可以减轻SCIRI损伤[1, 5, 6]。在本研究中，过表达miR-29b-3p可以明显改善IR大鼠脊髓功能，降低BSCB通透性(Fig 2)，维持运动神经元形态(Fig 3)，降低脊髓细胞凋亡率(Fig 4)，降低BMF、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达(Fig 6，7)。

七氟烷预处理可以明显保护大鼠SCIRI。多项研究表明，七氟醚预处理可以改善大脑、脊髓或心脏的缺血/缺氧性损伤[4, 8-10]，暴露于七氟烷也可能影响脏器中miRs的表达[9-11]。在本实验中，七氟烷预处理可以明显改善IR大鼠后肢运动障碍，降低BSCB通透性，增加健存的脊髓神经元数量，降低脊髓细胞凋亡率，降低凋亡通路蛋白BMF、Bax和cleaved caspase-3表达水平，以上皆表明七氟烷可以较好的维持脊髓功能，减轻脊髓IR损伤。七氟烷预处理时IR大鼠脊髓中miR-29b-3p的表达明显增加(Fig 5)，BMF的表达受到抑制(Fig 6,7)。七氟烷与miR-29b-3p mimic起到了类似的减轻脊髓IR损伤作用。诚然，考虑到生物系统的复杂性，需进一步的体外实验以更好地探索和研究七氟烷保护SCIRI的机制。

综上所述，miR-29b-3p通过调控BMF减轻大鼠SCIRI后的凋亡反应。七氟烷预处理可以在SCIRI中保护大鼠脊髓损伤，其机制可能与上调的miR-29b-3p相关。该研究将为预防和治疗脊髓损伤提供新思路和新靶点。

(致谢：本实验在中国医科大学附属第一医院实验中心、麻醉科实验室完成，在此，对以上实验室和实验过程中给予指导和帮助的老师表示感谢！)