梓醇对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡作用的研究

李尽文，宋代博，李苑华，麦键城，刘咏倩，李 莉

(广东医科大学药学院科研平台服务管理中心，广东 东莞 523808)

随着经济社会的不断发展，人口老龄化的不断加剧，恶性肿瘤已经成为危害人类生命健康的主要原因之一[1]。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率在妇科恶性肿瘤中居第一位，近年来其发病有年轻化的趋势。主要原因是由于HPV感染，其次可能的原因包括性生活过早、多个性伴侣、多孕多产；外在因素例如抽烟、喝酒、熬夜等不良生活习惯；高脂肪、高热量食品的过多摄入等与肿瘤发生发展密切相关[2]。传统的癌症治疗方案包括：放疗、化疗和手术治疗，但是放化疗杀死癌细胞的同时，对人体正常细胞也会造成不可逆转的影响，会带来如骨髓抑制、脱发等不良反应；手术治疗切除病灶会同时切除肿瘤周围部分正常的组织，而且有淋巴转移者预后差。因此急需寻找新的有效且毒副作用小的治疗方式来抵抗癌症。

伴随着中医中药近年来的发展，中药抵抗癌症的作用也不断被发掘，天然产物在治疗癌症过程中具有疗效好、低毒性、药源广等优势。地黄是中药方中一种常用的药物，具有清热凉血、养阴生津的功效[3]。梓醇(catalpol)是地黄根的主要活性成分，属于环烯醚萜类化合物。现代医学发现，其具有抗炎[4]、改善脑缺血[5]、抗阿尔茨海默症[6]、抗糖尿病[7]等作用。近年来，研究发现梓醇具有良好的抗肿瘤活性，如抗卵巢癌[8]、肝癌[9]、非小细胞肺癌[10]等等。本文拟配制不同浓度的梓醇溶液，以宫颈癌HeLa细胞为研究对象，探究其对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响。

1 实验材料与处理分组

1.1 实验材料

人宫颈癌HeLa细胞株(南京科佰生物科技有限公司)；梓醇catalpol(上海源叶生物科技有限公司)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青链霉素双抗(solarbio)；PBS(solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(solarbio)；MTT(BioFrox)；DMSO(solarbio)；Hoechst33342(南京碧云天生物公司)。

1.2 细胞培养

将HeLa细胞培养在含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM培养液中，培养设备为37℃、5% CO2的培养箱，平均每两天给细胞更换一次培养液，细胞长至80%左右用0.25%的胰蛋白酶对细胞进行消化传代处理，待细胞处于对数生长期时进行后续实验。

1.3 梯度浓度梓醇溶液的配制

称取3.62 mg的梓醇标准品粉末加入1 mL的DMEM培养液，配成浓度为10 mmol/L的梓醇溶液，再按照实验要求依次将其稀释到终浓度为0.25、0.5、1 mmol/L的梓醇溶液，现配现用。

1.4 实验分组处理

取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞数为3×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，待细胞经孵箱孵育至贴壁生长后，吸出原培养液。实验分组为：空白对照组(control)，加入完全培养基；梓醇高剂量处理组、梓醇中剂量处理组、梓醇低剂量处理组，每组设5个复孔。加入不同浓度的含药培养基后继续培养24、48 h，进行后续检测。将细胞接种于12孔板中，设空白对照组、梓醇高、中、低处理组，每组设3个复孔，不同处理24 h利用倒置显微镜镜下观察细胞形态的变化以及Hoechst核染检测细胞细胞凋亡。

2 实验方法

2.1 MTT细胞增殖检测

细胞经高、中、低浓度梓醇溶液处理(24、48 h)后，吸去培养液，每孔用PBS润洗1～2次，避免残留的药物与MTT反应而影响实验结果，然后每孔加入100 μL含 10% MTT (5 mg/mL)的DMEM培养液继续孵育。2～4 h吸去MTT溶液，每孔加100 μL DMSO后放入脱色摇床脱色10 min，置于酶标仪中测定孔中细胞的OD值，检测波长为490 nm。计算各组平均存活率并绘制细胞生长曲线。设置空白对照组的细胞存活率为100%，按公式计算各组细胞存活率：细胞存活率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%

2.2 细胞形态检测

细胞经过不同浓度梓醇处理24 h后，吸去培养液，每孔用PBS润洗1～2次，洗完孔内留少量PBS溶液。随即用倒置显微镜观察不同处理组细胞的形态变化。

2.3 Hoechst33342核染镜下细胞凋亡观察

细胞经过不同浓度梓醇处理24 h后，吸去培养液，每孔用PBS润洗1～2次，洗完孔内留少量PBS溶液。每孔加入200 μL Hoechst33342溶液，避光孵育5～10 min，孵育结束后吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗涤2～3次，每次3～5 min，洗涤完留少许PBS在孔内，然后直接在荧光显微镜下观察。

2.4 统计学分析

数据采用SPSS统计分析，实验数据以Mean±SD表示，用GraphPad Prism 8.0软件分析，所有实验结果均重复三次以上，结果采用单因素方差分析和t-test进行分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 梓醇抑制宫颈癌HeLa细胞增殖

梓醇的结构如图1。为明确梓醇抗宫颈癌HeLa细胞的增殖效果，实验采用高、中、低不同浓度的梓醇以及空白对照处理HeLa细胞24、48 h，用MTT实验检测不同浓度药物处理后HeLa细胞的吸光度。如图2所示，经梓醇处理的细胞存活率明显降低，与空白对照组相比梓醇以时间和剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖。

(A)2D结构，(B)3D结构

图2 梓醇对HeLa细胞增殖的影响

3.2 梓醇诱导HeLa细胞形态改变

不同浓度的梓醇溶液处理细胞后，显微镜下观察到随着梓醇浓度的增加，HeLa细胞数目逐渐减少，细胞开始收缩，核膜裂解并出现核固缩等凋亡形态变化，如图3所示。

图3 梓醇对细胞形态的影响

3.3 梓醇诱导HeLa细胞凋亡小体的产生

用Hoechst33342染液对不同浓度梓醇处理24 h的HeLa细胞进行染色，如图4所示，在荧光显微镜下梓醇高、中、低处理组均可明显观察到细胞核呈浓染致密的颗粒块状荧光，显示有凋亡小体的形成。实验表明，与对照组相比，梓醇能够诱导HeLa细胞发生凋亡。

图4 梓醇对细胞凋亡的影响

4 讨论

通常认为肿瘤的发生是由于癌细胞不受调控、无限增殖，肿瘤细胞中抑癌基因被抑制，而癌基因和原癌基因则被激活处于过表达状态，这些基因的变化和肿瘤的发生密不可分。细胞凋亡是机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞发生的程序性死亡。它受到严格的调控，涉及到一系列基因的激活或抑制、蛋白差异表达与相互作用以及信号通路的改变。细胞凋亡与肿瘤的关系同样密切，肿瘤细胞的凋亡机制不能正常运行，导致肿瘤无法通过凋亡路径被清除。因此通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞发生凋亡对于药物发挥抗肿瘤作用具有十分重要的意义。Yan[11]等研究发现蟾毒灵下调Cbl-b诱导乳腺癌细胞凋亡达到抗肿瘤的作用；Gao等[12]的研究表明雷公藤甲素能够上调 Bax同时下调 Bcl-2 的表达，从而诱导乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡；冯[13]等人研究发现半夏提取物能有效抑制白血病细胞增殖并促进其凋亡。本研究发现梓醇能够明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并诱导其发生凋亡，从而在抗肿瘤方面发挥重要作用。

5 结论与展望

综上所述，梓醇作为一种中药单体化合物，能够以时间和剂量依赖性来抑制宫颈癌细胞的增殖，并且通过诱导HeLa细胞凋亡而杀灭肿瘤细胞，从而实现抵抗癌症的作用。实验为梓醇抗肿瘤的药理作用提供一定的理论依据和研究基础，但是其抗肿瘤作用分子机制以及体内抗肿瘤的作用尚未可知，需待进一步研究探索。