鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系

隋欣 ,徐岩 ,周佳,王伟楠,张明天,韩冬,李娜,杨擎,曲晓波,黄晓巍

（1.长春中医药大学附属医院实验中心，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；3.长春中医药大学药学院药物化学与中药化学教研室，吉林 长春 130117；4.长春中医药大学吉林省人参科学研究院药理组，吉林 长春 130117）

随着现代社会人口老龄化问题的日益加剧，软骨损伤因具有难以修复、病程长且易反复等特点，现已成为影响老年人生活质量的主要因素之一［1-2］。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，可在特定条件下分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，转化生长因子和黄酮类化合物等诱导剂可以促进这一过程的发生，甚至产生靶向作用［3-5］。梅花鹿鹿茸是吉林省道地优势药材，具有“强筋骨”之功效，近千年来一直被广泛应用于各类骨病治疗［6］。鹿茸中含有大量的胶原蛋白，其中Ⅰ型胶原蛋白约占90%，已被证实作为医用生物材料对缺损组织修复、再生和重建具有重要意义［7］。但鹿茸Ⅰ型胶原（velvet antler collagen type Ⅰ，VACTⅠ）是否具有诱导BMSCs 成软骨分化的作用目前尚无报道。本研究通过体外细胞实验，观察VACTⅠ对BMSCs 增殖、细胞周期以及成软骨相关因子骨形态生成蛋白4（BMP-4）、转录因子Sox9、Ⅱ型胶原（type Ⅱcollagen）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的影响，探讨其诱导BMSCs成软骨化的潜在可能及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器4 周龄SD 大鼠，雄性，清洁级，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK（吉）2016-0003。VACTⅠ由长春中医药大学提供；兔抗大鼠Ⅱ型胶原（货号：15943-1-AP）、兔抗大鼠聚集蛋白聚糖（货号：13880-1-AP）和山羊抗兔二抗HRP（货号：SA00001-2）购于武汉三鹰生物技术有限公司，SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（货号：P1200）、全蛋白提取试剂盒（货号：BC3711）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：PC0020）、ECL 化学发光法检测试剂盒（货号：SW2010）和彩虹245 广谱蛋白Marker（货号：PR1920）购于北京索莱宝科技有限公司，增强型CCK-8 试剂盒（货号：BA00208）购于北京博奥森生物技术有限公司。Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo 公司），Alliance Q9 型凝胶成像仪（英国UVItec 公司），Gallios 型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），Nanodrop 2000 型微量分光光度计（美国Thermo 公司），CFX Connect 型荧光定量PCR 仪和CFX Manager 型采集及分析软件（美国Bio-Rad公司）。

1.2 大鼠BMSCs 的原代及传代培养大鼠脱颈椎处死后75%酒精浸泡10 min，超净工作台中切取双侧股骨，75%酒精浸泡2 min，移入新的超净工作台中，剪去两端干骺端用PBS 缓冲液反复冲洗出骨髓细胞至离心管中，800 r·min－1离心5 min，收集BMSCs，接种于含10%FBS 和100 U·mL－1双抗的DMEM 培养基中，在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养，差时贴壁法纯化细胞，待细胞生长至80%～90%时，使用含EDTA 的0.25%胰酶消化传代，取第3～5 代细胞用于实验。

1.3 CCK-8 法检测BMSCs 增殖率取第3 代BMSCs，用胰蛋白酶消化后以每孔3 × 104个细胞的密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔1 mL，孵育24 h 后分别加入条件培养液。实验分为空白对照组、转化生长因子β3（TGF-β3）组（给予浓度为10 μg·L－1TGF-β3）和不同浓度VACTⅠ（给药浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g·L－1）组。连续培养24、48 和72 h 后，弃去培养液，每孔加入CCK-8 10 μL 和DMEM 190 μL，孵育4 h，酶标仪检测450 nm 处吸光度（A）值。细胞增殖率＝实验组A 值/空白对照组A 值。

1.4 ELISA 法检测细胞上清液中BMP-4 和Sox9水平按照武汉酶免生物科技有限公司ELISA 试剂盒说明书检测各组细胞上清液中BMP-4 和Sox9水平，于450 nm 波长处依次读取各孔的A 值。以标准品浓度为横坐标，A 值为纵坐标制作标准曲线，求出回归方程，计算各样品水平。

1.5 流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率制备浓度为1 × 106mL－1的细胞悬液1 mL，离心后去上清，在细胞中加入70% 预冷乙醇500 μL 固定2 h，4℃保存，染色前用PBS 缓冲液洗去固定液。加入100 μL RNase A 溶液，重悬细胞，37℃水浴30 min，再加入400 μL PI 染色液混匀，4℃避光孵育30 min，流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率。

1.6 RT-PCR 法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA 表达水平按美国Axygen 公司提供的AxyPrep 总RNA 小量制备试剂盒提取各组细胞总RNA，NanoDrop 2000 超微量分光光度计测定总RNA 浓度。按照日本TaKaRa 公司提供的逆转录试剂盒操作规程逆转录合成cDNA 第一链，-20℃储存备用。以cDNA 链作为模板，进行PCR扩增反应，反应体系：5×iScript Reaction Mixture 4 μL，iScript Reverse Transcriptase 1 μL，RNA template 1 μ g，加Nuclease-free water 至20 μL；反应条件：37℃孵育60 min，85℃孵育5 min，冰浴5 min，合成的cDNA 于-20℃储存备用。以cDNA 链作为模板，进行PCR 扩增反应，20 μL 反应体系：iTaqTMuniversal SYBR Green supermix（2×）10 μL，Forward and reverse primers 1.8 μ L，DNA template 1 μ L，加H2O 至20 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40 循环扩增反应后，72℃、5 min。将96 孔细胞培养板放入荧光定量PCR 仪中，并在Bio-Rad CFX Manager 软件上设定检测。PCR 引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

1.7 Western blotting 法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平提取各组细胞总蛋白，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度，调节浓度为2 g·L－1，将蛋白样品与2×样品缓冲液按体积比1∶4 混合后，100℃水浴5 min；制备SDS-PAGE 凝胶，每孔加样20 μL，280 mA 恒定电流转膜60 min。转膜结束后，取出PVDF 膜，采用TBST 洗涤3 次，每次5 min，之后将膜放入5%脱脂奶粉中，水平摇床，室温下封闭2 h。封闭结束后，TBST 浸洗3 次，每次5 min，分别加入Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖一抗（1∶1 000）稀释液，4℃储存，过夜。加HRP标记二抗（1∶2 000），水平摇床，室温封闭2 h。加入ECL 发光显色液后将膜正面朝上放到凝胶成像仪内，记录结果。对电泳条带进行灰度值扫描，对各目的蛋白进行半定量分析。以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。各组BMSCs 增殖率，细胞中BMP-4和Sox9 水平，不同细胞周期细胞百分率，细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA 及蛋白表达水平以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 各组BMSCs 增殖率与空白对照组比较，1.25 g·L－1VACTⅠ组大鼠BMSCs 增殖率差异无统计学意义（P＞0.05），2.50～20.00 g·L－1VACT Ⅰ组大鼠BMSCs 增殖率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈时间剂量依赖性；与TGF-β3 组比较，2.50 g·L－1VACT Ⅰ组大鼠BMSCs 增殖率差异无统计学意义（P＞0.05），故选用2.5 和5.0 g·L－1VACTⅠ组进行后续实验。见表2。

2.2 各组BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平与空白对照组比较，TGF-β3 组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4 和Sox9 水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

2.3 各组不同细胞周期BMSCs 百分率与空白对照组比较，TGF-β3 组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs 百分率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4 和图1。

表2 各组BMSCs 增殖率Tab.2 Proliferation rates of BMSCs in various groups（n＝5,）

表2 各组BMSCs 增殖率Tab.2 Proliferation rates of BMSCs in various groups（n＝5,）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

表3 各组BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平Tab.3 Levels of BMP-4 and Sox9 in cell supernatant of BMSCs in various groups [n＝5,,ρB/(ng·L－1）]

表3 各组BMSCs 上清液中BMP-4 和Sox9 水平Tab.3 Levels of BMP-4 and Sox9 in cell supernatant of BMSCs in various groups [n＝5,,ρB/(ng·L－1）]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

2.4 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平与空白对照组比较，TGF-β3 组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05）。见图2和表5。

图2 RT-PCR 法检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA 表达水平Fig.2 Expression levels of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA in cells in various groups detected by RT-PCR method

表4 各组不同细胞周期BMSCs 百分率Tab.4 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups（n＝5,,η/%）

表4 各组不同细胞周期BMSCs 百分率Tab.4 Percentages of BMSCs in different cell cycles in various groups（n＝5,,η/%）

表5 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA 表达水平Tab.5 Expression levels of type Ⅱcollagen and aggrecan mRNA in cells in various groups（n＝5,）

*P＜0.01 compared with blank control group.

2.5 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平与空白对照组比较，TGF-β3 组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表6 和图3。

表6 各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平Tab.6 Expression levels of collagen type Ⅱand aggrecan proteins in cells in various groups（n＝5,）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank control group.

3 讨论

骨折是骨质疏松最严重的并发症，严重影响老年人生活质量，其愈合过程及机制不同于一般骨折，在手术治疗的同时应给予必要的抗骨质疏松治疗及促软骨生成［8-9］。BMSCs 具有来源广、多向分化潜能且应用技术成熟等特点，是软骨组织工程修复最理想的工具。通过诱导剂靶向诱导BMSCs 成软骨分化是现代研究的热点，目前常用的诱导剂包括骨形态发生蛋白2（BMP-2）、地塞米松和TGF-β3等；此外巴戟天多糖、柚皮苷和淫羊藿苷等中药提取物也具有诱导剂的潜质［10-13］。鹿茸作为中药传统名贵药材，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任和托疮毒之功效，一直以来作为宫廷药膳食材应用历史悠久［14］。研究［15］表明：胶原是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，具有很高的生物学活性，鹿茸中含有丰富的Ⅰ型胶原，已被证实对多种骨病具有治疗作用。

本研究结果表明：2.5～20.0 g·L－1VACTⅠ对大鼠BMSCs 增殖率起到不同程度的抑制作用，且细胞增殖率与时间和剂量呈负相关关系。BMP-4在肥大软骨细胞和成熟的骨细胞中广泛表达，可以促进软骨组织早期形成，而Sox9 是软骨发育形成中的重要转录因子，在软骨的发育成熟等过程中发挥重要的调节作用［16-17］。本研究中ELISA 法检测结果表明：VACTⅠ诱导可促进细胞释放BMP-4和Sox9，VACTⅠ在抑制BMSCs 增殖的同时具有诱导其向软骨细胞分化的潜质。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白是Sox9 调控的下游靶点蛋白，也是软骨组织的特征性蛋白，二者表达增加是软骨组织修复的标志过程［18-20］。本研究中RT-PCR 法和Western blotting 法检测结果表明：VACTⅠ可上调BMSCs 中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达水平，但诱导过程中各组细胞周期未发生明显变化。

综上所述，VACTⅠ可通过提高BMSCs 中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平抑制其增殖，是一种潜在的成软骨分化诱导剂。