一测多评法同时测定清热疏肝口服液中8种活性成分

刘艳芬，马 云

0 引言

清热疏肝口服液由茵陈、白芍、柴胡、板蓝根和桃仁配伍而成，主要用于急性黄疸型肝炎、慢性肝炎属肝胆湿热证等病症的治疗[1]。中药及其制剂所含有效成分复杂，其临床疗效为多个成分共同作用的结果，清热疏肝口服液现行质量标准仅对该制剂所含单一成分进行定量控制，也未检索到对该制剂多成分质量控制的文献报道，单一成分难以全面评价清热疏肝口服液的产品质量，本文参考中药质量标志物确定原则，选取君药茵陈所含活性成分滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，臣药柴胡所含特征性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，佐药白芍所含主要活性成分氧化芍药苷和芍药苷为检测目标成分，以异槲皮苷为内参物，首次采用一测多评法[2]，实现对清热疏肝口服液中8种活性成分含量的同时测定，建立了清热疏肝口服液多指标成分质量控制模式，为全面评价清热疏肝口服液的产品质量、完善该制剂的质量标准提供参考数据。

1 仪器与材料

Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BS224S型电子天平(德国Sartorius公司)；Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

滨蒿内酯对照品(批号：111511-201704，CAS号：120-08-1，含量以99.9%计)、芍药苷对照品(批号：110736-201943，CAS号：23180-57-6，含量以95.1%计)、金丝桃苷对照品(批号：111521-201809，CAS号：482-36-0，含量以94.9%计)、异槲皮苷对照品(批号：111809-201804，CAS号：482-35-9，含量以97.2%计)、柴胡皂苷a对照品(批号：110777-201912，CAS号：20736-09-8，含量以94.8%计)和柴胡皂苷d对照品(批号：110778-201912，CAS号：20874-52-6，含量以96.3%计)均来源于中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷对照品(批号：18031641，CAS号：39011-91-1，含量以98.8%计)和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品(批号：18010521，CAS号：57378-72-0，含量以99.7%计)均来源于上海同田生物技术股份有限公司；清热疏肝口服液(规格：每支装10 ml，批号：181011、190218、190517)来源于清华德人西安幸福制药有限公司；乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品各适量，用甲醇制成各目标成分质量浓度分别为0.258、1.392、1.156、0.494、0.176、1.742、0.418、0.352 mg/ml的8个对照品储备液；精密吸取8个对照品储备液各2.5 ml，置50 ml量瓶中用甲醇制成混合对照品溶液(氧化芍药苷12.9 μg/ml、芍药苷69.6 μg/ml、滨蒿内酯57.8 μg/ml、金丝桃苷24.7 μg/ml、异槲皮苷8.8 μg/ml、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸87.1 μg/ml、柴胡皂苷a 20.9 μg/ml和柴胡皂苷d 17.6 μg/ml)。

2.1.2 清热疏肝口服液供试品溶液 精密量取清热疏肝口服液1.0 ml，置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得清热疏肝口服液供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液 按清热疏肝口服液质量标准项下工艺处方分别制备缺茵陈、缺柴胡、缺白芍的3种阴性样品，再按“2.1.2”项下方法分别制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 以Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，柱温为30 ℃；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱(0～12.0 min，15.0%A；12.0～22.0 min，15.0%A→21.0%A；22.0～49.0 min，21.0%A→35.0%A；49.0～64.0 min，35.0%A→42.0%A；64.0～70.0 min，42.0%A→15.0%A)，体积流量1.0 ml/min；检测波长分别为230 nm[3-6](0～22.0 min检测氧化芍药苷和芍药苷)、345 nm[3,7-8](22.0～49.0 min检测滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸)和210 nm[3,9](49.0～70.0 min检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)；进样量10 μl。在上述色谱条件下，取“2.1.1”项下的混合对照品溶液以及“2.1.2～2.1.3”项下各溶液依法进样检测，记录所检测色谱图。结果目标成分氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰均能达到有效分离，分离度均>1.5，理论塔板数按待测目标成分峰计均不低于4 500。所记录色谱图基线平稳，各阴性样品色谱图中在与样品中氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d保留时间相对应位置上未见色谱峰，表明阴性样品对清热疏肝口服液中8种成分的定量测定无干扰，HPLC色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.3 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下的8个对照品储备液各2.0 ml，置同一20 ml量瓶中，用甲醇制成线性关系混合对照品溶液1，精密吸取混标溶液1各适量，依次用甲醇稀释2、5、10、15、20倍，制成线性关系混合对照品溶液2～6，取上述6种混合对照品溶液依法进样检测，记录氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰的峰面积，以质量浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，见表1。

表1 8个成分线性关系和范围

2.4 精密度、重复性、稳定性考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液适量，重复进样6次，记录氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰峰面积，结果各成分峰面积的RSD分别为1.11%、0.67%、0.71%、0.96%、1.25%、0.53%、1.02%和0.89%。

2.4.2 重复性考察 取同一批次的清热疏肝口服液样品适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，依法进样检测，记录氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰峰面积，计算各待测目标成分的含量，结果所测各成分含量的RSD分别为1.83%、1.02%、1.15%、1.44%、0.75%、0.91%、1.38%和1.50%。

2.4.3 稳定性考察 临用新配1份清热疏肝口服液供试品溶液，于制备后0、4、8、12、18、24 h依法进样检测，记录氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰峰面积，结果各待测成分峰面积的RSD分别为1.07%、0.62%、0.68%、0.94%、1.21%、0.56%、0.99%和0.87%，表明清热疏肝口服液供试品溶液24 h内稳定。

2.5 加样回收率试验 精密量取已知含量的清热疏肝口服液样品0.5 ml，共9份，置25 ml量瓶中，按照中国药典2015年版四部要求，分别精密加入根据已知各待测成分含量另行配制的混合对照品溶液(氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d质量浓度分别为0.142、0.894、0.658、0.266、0.098、1.072、0.234、0.188 mg/ml)0.5 ml 3份、1.0 ml 3份、1.5 ml 3份，使待测目标成分对照品加入量约为样品含量的50%、100%和150%，再按“2.3”项下方法制备加样样品溶液。依法进样检测，结果所测成分氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的平均加样回收率及相应的RSD分别为98.27%(1.50%)、99.00%(0.53%)、99.82%(0.81%)、97.93%(1.44%)、97.68%(1.16%)、100.04%(0.64%)、98.90%(0.97%)、96.86%(1.09%)。

2.6 相对校正因子的测定 本研究以异槲皮苷为内参物，分别计算其与氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的相对校正因子。取线性关系考察项下6种混合对照品溶液依法进样测定，记录氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面积，按公式fi/s=fi/s=(Wi×As)/(Ws×Ai)(式中W代表质量浓度，A代表峰面积，i代表内参物，s代表其他待测组分)分别计算氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的相对校正因子，结果见表2。

2.7 相对校正因子耐用性考察

2.7.1 不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响 本研究考察了Waters 2695型、Agilent 1100型2种型号高效液相色谱仪和Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 3种型号色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表3。

2.7.2 不同柱温对相对校正因子的影响 本研究考察了不同柱温(28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃)对相对校正因子的影响，结果见表4。

2.7.3 待测组分色谱峰的定位 本研究以内参物异槲皮苷色谱峰为基准峰，分别考察Waters 2695型、Agilent 1100型2种型号高效液相色谱仪和Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 3种型号色谱柱条件下，采用相对保留时间值法对色谱峰进行定位考察，结果见表5。

表2 以异槲皮苷为内参物的7种成分的相对校正因子

表3 不同仪器、不同色谱柱对相对校正因子的影响

表4 不同柱温对相对校正因子的影响

表5 不同仪器、不同色谱柱待测成分色谱峰的相对保留值

2.8 一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)结果比较 取3个批次的清热疏肝口服液样品适量，按“2.1.2”项下方法每个批次平行制备3份清热疏肝口服液样品溶液，依法进样检测，记录各成分色谱峰的峰面积，分别采用外标法和一测多评法计算各成分的含量，结果见表6。

表6 各成分含量测定结果(mg/ml)

3 讨论

3.1 待测目标成分的确定 清热疏肝口服液由茵陈、白芍、柴胡、板蓝根和桃仁5味药材加工而成，方中茵陈清利湿热、利胆退黄，为君药；柴胡、板蓝根疏肝解郁、散热升阳、清热凉血，合为臣药；白芍养血柔肝、平抑肝阳，为佐药；桃仁活血祛瘀、润肠通便，为使药。诸药共奏，以达清热利湿、疏肝解郁、和血通络的功效。茵陈为菊科植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部分，主要含有黄酮类、香豆素类、有机酸类等多种化学成分，其中滨蒿内酯、东莨菪内酯、秦皮乙素等为其香豆素类代表性成分，具有抗炎、抗肝损伤作用，金丝桃苷、异槲皮苷和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸等为其黄酮类主要成分，对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤有保护作用；柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，主要含有皂苷类、挥发油类、黄酮类、多糖类等成分，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等皂苷类为其主要活性成分，具有解热、抗炎、抗肿瘤、保肝、免疫调节等药理作用；白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等单萜类成分为其主要活性成分，具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多种药理作用。本文选取清热疏肝口服液方中君药茵陈所含滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，臣药柴胡所含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，佐药白芍所含氧化芍药苷、芍药苷为定量测定目标成分，为全面评价清热疏肝口服液产品质量提供依据。

3.2 供试品溶液制备方法的确定 供试品溶液的制备方法直接影响所建立方法的可行性和检测结果的准确性，本实验依次对不同提取溶剂(甲醇[3,6,9-10]、50%甲醇、乙醇、50%乙醇[3-5,7])、提取方式(超声提取法[5-6,9-10]和加热回流提取法[3-4,7-8])和提取时间(15 min、30 min、60 min)进行了对比考察，以清热疏肝口服液中待测目标成分氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的综合提取率为考察指标，同时结合加样回收率试验结果，最终确定采用甲醇超声提取30 min作为清热疏肝口服液供试品溶液的制备方法。

3.3 色谱条件流动相的选择 色谱条件中流动相直接决定了待测目标成分的分离效果，本实验首先对比考察了乙腈-水[3,9-10]、甲醇-水[8]2个流动相系统，以待测目标成分氧化芍药苷、芍药苷、滨蒿内酯、金丝桃苷、异槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的分离效果、峰形以及色谱峰基线的平稳情况为综合考察指标，结果以乙腈-水为流动相时效果较佳，但待测目标成分氧化芍药苷、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸分离效果欠佳，金丝桃苷色谱峰存在拖尾现象；在此基础上，对流动相中水相(0.1%甲酸水溶液、0.1%磷酸水溶液[3-4,7-8,11]、0.1%冰醋酸水溶液[5])进行了对比考察，最终确定采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，按正文中的流动相比例梯度洗脱对清热疏肝口服液中8种活性成分进行同时检测，在此条件下所记录色谱图基线平稳，待测目标成分均能达到有效分离，色谱峰峰形良好。

本文首次采用一测多评法，实现了对清热疏肝口服液中8种活性成分的同时测定，建立了清热疏肝口服液多指标成分控制方法，所建立的方法操作便捷、结果准确，节约了检验成本，为全面评价清热疏肝口服液的产品质量，确保清热疏肝口服液产品质量的均一性和临床治疗效果的一致性提供了参考依据。