红景天苷通过调控Nrf2表达对db/db型鼠糖尿病肾病保护作用的研究

殷白丁，胡玉霞，靳 红，吐达洪，汪 晶*

0 引言

糖尿病的微血管并发症在糖尿病中占有相当大的比例[1]。其中，糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病对肾脏组织最严重的一种损伤，是终末期肾脏疾病和肾衰竭的主要原因[2-3]。研究表明，大约有15%～40%的1型或2型糖尿病患者患有DN[4]。除了慢性持续性高血糖，包括慢性炎症、血脂障碍和高级糖基终产物(Advanced glycation end products,AGEs)积累在内的其他因素也能很大程度上影响DN的发病和进程[5]。

AGEs与DN的发病机制密切相关，氨基胍和吡多胺等AGEs抑制剂能减轻糖尿病患者的肾损害[6]。研究表明，AGEs不但能与其受体发生相互作用，随之改变细胞内发出促进炎性细胞因子释放的信号，还能与其他通路相互沟通[7]。糖尿病中过多的AGEs会触发细胞凋亡通路，AGEs诱导的凋亡能引起基底膜增厚，最终导致肾小球功能丧失[8]。DN的动物模型阐释了抑制AGEs形成或抑制AGEs诱导凋亡的药物都具有一定的肾脏保护作用。

细胞核因子2相关的因子2/抗氧化反应元素(Nrf2/ARE)发出的信号在控制编码内生抗氧化酶基因转录调节中发挥着关键作用[9]。第Ⅱ阶段抗氧化酶包括血红素加氧酶-1(HO-1)、烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸[NAD(P)H]奎宁氧化酶-1(NQO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。有报道，由于有抑制氧化应激、提高肾脏保护功能的作用，Nrf2介导的抗氧化酶成为了一种有前途的治疗靶点[10]。

Sal是一种从中药红景天中分离出来的植物皂苷，可以治疗心血管疾病和脑血管疾病[11]。文献报道，Sal通过抑制BIM介导的大鼠近端肾小管细胞凋亡对DN起保护作用[12]。此外，Sal通过上调opg/rankl比率改善卵巢切除糖尿病大鼠的骨组织形态并防止骨丢失[13]。然而，Sal对于DN的作用尚未明确，相关分子机制也仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料 红景天苷购自上海阿拉丁生物科技发展有限公司(上海，中国)。二甲双胍(中美施贵宝制药有限公司，上海，中国)作为阳性对照。细胞培养材料:杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素均购自Gibco(上海，中国)。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)、锌原卟啉(ZNPP)和其他化学用品均购自西格玛·奥尔德里奇(美国)。AGE测定试剂盒购自上海韦斯坦生物科技有限公司。Caspase-3以及caspase-9细胞活性试剂盒(碧云天，中国)，Nrf2(sc-13032)、Bcl-2(sc-7382)和Bax(sc-4239)购自圣克鲁斯生物技术公司。其他相关试剂以及β-actin均购自碧云天生物科技有限公司(上海，中国)。

AGE/牛血清白蛋白(BSA)的制备：根据Zhang等[3]的方案制备了AGE-BSA。用0.792 6 g D-葡萄糖在37 ℃下培养8周，将0.07 g牛血清白蛋白加入PBS中。对照白蛋白在没有葡萄糖的情况下培养。使用皮尔斯内毒素去除凝胶去除内毒素，并使用毒素传感器TM显色LAL，内毒素检测试剂盒(金斯瑞生物科技，美国)检测内毒素，规格小于500 U/L。

1.2 动物和分组 雌性db/db鼠(db/db mice)和C57BL/6J鼠(db/m，6～8周龄)均购自维通利华动物研究中心(北京，中国)。实验所有动物均在标准条件(室温22 ℃，湿度60%，光/暗循环)下培养，并摄入标准颗粒物以及足够饮用水。所有动物实验均已被中国医学科学院实验动物委员会和北京协和医学院批准，并按照美国卫生部出版的《国家实验动物保健和使用指南》(NIH第85-23号出版物，1996年修订)进行操作。在戊巴比妥麻醉下进行所有动物实验和处死，并且尽可能让动物少遭受痛苦。

1.3 实验方案 所有实验动物进入相应培养环境适应2周后，采用血糖仪(Roche)测量尾血糖水平。将空腹血糖>200 mg/dl的db/db型鼠视为糖尿病，并用于进一步的实验。将鼠随机分为4组(n=8)：C57BL/6组(对照组)；db/db组(模型组)；db/db+二甲双胍200 mg/(kg·d)组(MET组)；db/db+二甲双胍200 mg/(kg·d)+红景天苷30 mg/(kg·d)组。用灌胃的方法给药20周。将灌胃处理20周后的对照组和模型组鼠放在代谢笼中,测量其糖尿病相关指标。

1.4 血生化指标检测

1.4.1 空腹血糖、血清TCH和TG水平检测 每4周测量1次过夜禁食鼠的空腹血糖(FBG)水平。20周后，用颈椎离断法处死实验动物。处死前从眼眶后静脉丛采样，用生化试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)测定血清总胆固醇(TCH)和三酰甘油(TG)水平。

1.4.2 血清β2-微球蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、AGE和尿白蛋白水平检测 离心法(1 000×g，10 min，4 ℃)分离各组血样中的血清样品。按照说明书使用多模式酶标仪(Synergy Hi、Biotek、Winooski、VT、USA)和商用试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)测定β2-MG、BUN、CR和AGE水平。根据说明(KA0489，Abnova，台北，台湾)使用白蛋白(鼠)ELISA试剂盒测量尿白蛋白。尿白蛋白排泄量以24 h排泄总量表示。

1.5 组织病理学检查 将肾脏样本固定在4%的缓冲多聚甲醛中，脱水后嵌入石蜡中。每个嵌入样本切下厚约4 μm的切片，并用苏木精和伊红(HE)染色，使用光学显微镜进行检查。

1.6 细胞培养 人肾近端小管(HK-2)细胞购自中国科学院(上海)细胞库，在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM(葡萄糖含量5.5 mmol；Gibco，上海，中国)的培养基中，37 ℃、5%CO2的孵箱中培养。所有细胞根据实验设计以适当的密度铺满培养皿中，并在实验前培养24 h以达到60%～70%的浓度。

1.7 细胞活性测定 MTT法测定HK-2细胞的细胞活性。在96孔板(1×104个细胞/孔)中培养，细胞经不同处理后，在37 ℃的温度条件下，用MTT溶液(1 mg/ml最终浓度)培养4 h。二甲基亚砜(DMSO，150 μl/孔)溶解，用酶标仪在570 nm波长处检测不同孔的吸光度。用MTT降低的百分比表示细胞活性。按照caspase-3以及caspase-9活性试剂盒操作流程检测HK-2细胞的细胞活性。用酶标仪检测相应的吸光度。

1.8 Western blot实验 用含1%苯甲磺酰氟醚的蛋白质提取试剂盒(CoWin Bioscience Co.，Ltd.，Beijing，China)分离细胞质和细胞核蛋白。通过电泳的方法在10% SDS-PAGE凝胶上分离等量(60～80 μg)的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜(Millipore Corporation公司，美国)上。在含有5%(w/v)脱脂奶粉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，TBST)中室温封闭2 h。然后用适当的一抗在4 ℃条件下孵育过夜。之后，用TBST进行3次洗涤，并室温下二抗孵育2 h。用增强化学发光法进行结果观察。

1.9 统计学分析 采用单因素方差分析和纽曼-科伊尔斯检验法检测实验数据。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sal对db/db型鼠血清中FBG、TCH和TG水平的影响 Sal以及MET治疗20周后，与模型组相比，Sal以及MET能够明显降低db/db鼠血清中FBG的含量(图1A)。与模型组相比，Sal或MET能够明显逆转db/db鼠血清中TCH和TG水平的降低(图1B)。

2.2 Sal对db/db型鼠肾功能的影响 与对照组相比，db/db组24 h尿量和尿蛋白水平明显升高(P<0.01)。MET和Sal处理20周后24 h尿量和尿蛋白水平明显降低(P<0.01)。与对照组相比，模型组β2-MG、CR和BUN表达水平明显升高，分别增加了115.31%、143.48%和93.11%(P<0.01)。MET和Sal能够明显抑制β2-MG、CR和BUN水平的升高。且Sal组β2-MG、CR和BUN水平分别降低了22.93%、54.07%和15.33%(P<0.05)。Sal和MET能明显抑制模型组血浆中AGEs的表达。见图2。

2.3 红景天苷对组织病理学变化的影响 HE染色结果显示，与对照组相比，糖尿病模型组肾小球体积增大，肾小球膜细胞增殖异常增加。模型组肾脏组织出现明显的炎性浸润区(图3A)。Sal和MET能够减轻模型组肾脏结构异常(图3A)。如图3B所示，与对照组相比，模型组中TGF-β1和胶原蛋白的表达明显升高(P<0.05)。Sal以及MET能够明显降低TGF-β1和胶原蛋白表达增加(P<0.05)。

2.4 Sal逆转AGE诱导的HK-2细胞死亡 AGEs(0、50、100、200、400 μg/ml)刺激HK-2细胞24 h后，HK-2细胞活性呈浓度梯度样降低。Sal(25 μmol/L，24 h)能够逆转由AGE(400 μg/ml)诱导的HK-2细胞活力以及LDH表达降低(P<0.05)。见图4。

2.5 Sal对AGE诱导HK-2细胞凋亡的影响 与对照组相比，Sal可以逆转AGEs诱导的HK-2细胞活性降低。Sal逆转AGEs诱导HK-2细胞中Bcl-2表达上调以及Bax表达下调；Sal逆转AGE导致的HK-2细胞中caspase-3和caspase-9的活性升高(P<0.05)。Sal能够逆转由AGEs诱导的Nrf2蛋白表达降低(P<0.05)。见图5。

图1 红景天苷对db/db型鼠FBG、TCH和TG水平的影响

图2 红景天苷对db/db鼠尿蛋白量和肾功能指标的影响

图3 红景天苷对组织病理学变化的影响

图4 Sal逆转由AGEs诱导的HK-2细胞死亡

图5 Sal对AGE诱导HK-2细胞凋亡的影响

3 讨论

DN是糖尿病患者发生的一种进行性微血管并发症，其特点为肾脏微血管破裂，肾小球毛细血管和肾小管间质受到损害[1]。研究表明，慢性高血糖诱导的氧化应激可以引发DN的退行性通路[4]。氧化应激不仅能导致DN中蛋白尿发病机制的重要因素-足细胞凋亡，还可以加速肾小球系膜细胞(MC)增殖以及细胞外基质(ECM)蛋白过量增多[10]。本研究表明，Sal对AGEs处理的db/db型糖尿病鼠和HK-2细胞的凋亡均有保护作用。db/db鼠表现出特征性肾脏功能紊乱，包括FBG、TG、TCH、BUN和CR水平升高以及肾小球结构异常。而Sal及MET均可以降低db/db鼠的尿白蛋白，降低血清TG、TCH、BUN、CR以及β2-MG的水平，减轻肾的病理结构变化程度，使TGF-β1和胶原蛋白Ⅰ的表达水平下调，对DN的保护作用很明显。此外，Sal通过促进Nrf2在AGEs处理的糖尿病鼠和HK-2细胞中的表达，抑制细胞凋亡。

研究表明，TGF-β信号通路是DN发展中起关键作用的一条通路，且在糖尿病患者和动物模型的肾小球中被激活[14]。研究发现，AGEs可以诱导TGF-β信号激活[15]。本研究结果表明，AGEs处理的糖尿病鼠和HK-2细胞中TGF-β1和胶原蛋白Ⅰ表达均上调，Sal能够逆转由AGE诱导的TGF-β1和胶原蛋白Ⅰ表达上调，表明Sal可能通过抑制TGF-β1通路抑制糖尿病诱导的纤维化。同时，AGEs可降低HK-2细胞活性，增加细胞LDH表达，而Sal能够逆转由AGEs诱导的细胞死亡。以上结果表明，Sal可通过减轻AGEs诱导的损伤起到保护作用。

综上所述，Sal通过促进Nrf2表达来调节线粒体凋亡途径，进而参与了DN对于肾脏细胞的损伤，产生与MET相似的作用。同时，本研究结果表明，Sal可能对除葡萄糖控制以外的DN具有潜在的治疗作用。