西双版纳热带植物园锈病的发生及病原菌鉴定初报①

2020-10-19 08:54:24张肖肖张绍钰刘林

广西植保 2020年3期

张肖肖，张绍钰，刘林

（1.中国科学院西双版纳热带植物园勐腊县 666303；2.普洱学院生命科学系普洱市 665000；3.云南农业大学昆明市 650000）

锈病是园林花卉和树木较常见的一种病害，广泛分布于世界各地，主要为害豆科、菊科、鸢尾科、百合科、蔷薇科、夹竹桃科、禾本科等多种园林花卉和树木[1]。该病是由担子菌纲锈菌目真菌引起的，因形成黄色、红褐色、褐色等颜色的锈状孢子堆或粉层而得名锈菌[2-3]。目前全世界已报道的锈菌有7 798种，隶属14科166属[4-5]。

中国科学院西双版纳热带植物园（以下简称西双版纳热带植物园）是集科学研究、物种保存和科普教育为一体的综合性研究机构和国内外知名的风景名胜区。西双版纳热带植物园占地面积约1 125 ha，收集活植物13 000多种，建有38个植物专类区，保存有一片面积约250 ha 的原始热带雨林，是我国面积最大、收集物种最丰富、植物专类园区最多的植物园，也是世界上户外保存植物种数和向公众展示的植物类群最多的植物园。

本文通过系统调查西双版纳热带植物园内植物锈病的发生情况，旨在了解发生锈病的植物种类、分布区域、发生期、为害程度（发病率、病情指数），通过形态学鉴定和分子学鉴定，鉴定引起植物锈病的病原菌，掌握锈菌与植物的生态关系，为园区植物科学配置、锈病防控及进一步试验研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 调查时间及地点

2017—2018 年，对西双版纳热带植物园内植物发生锈病情况进行全面调查。

1.2 调查方法

采取普查与定期观测相结合的方法。普查是每周进行1次全覆盖观察，看是否有新的锈病植物发生，记录发生锈病植物的种类和区域，定期观测是对已发生锈病的植物进行每周1 次定期观察，掌握锈病发生发展情况，并在盛发期统计发病率和病情指数。

1.3 病害标本采集

根据发病植物性状及种植情况，并参考《园林病虫害防治技术》中叶部病害调查方法，采取随机取样法，随机调查100片叶片。分上、中、下共3 个部位，每个部位按东、南、西、北4个方向选取叶片。采集典型病害标本，用于锈病病原菌鉴定。

1.4 锈病为害程度分级

锈病发生的严重程度一般用0～9级或0～4级表示，根据孢子堆占叶片的面积，参照郑磊等分级标准[4，6-7]，结合园内植物发病情况，将锈病为害程度分为0～4级（表1）。

表1 锈病发病程度分级标准

1.5 数据统计方式

2 锈病病原菌鉴定

2.1 病原菌形态学鉴定

对于采集的病害标本，用镊子挑取锈病植株叶片病征物（如颗粒状物、粉状物等）或者用徒手切片法切取叶片病斑薄片后，置于滴加1滴无菌水的载玻片上，加盖玻片后在莱卡荧光显微镜下观察夏孢子和冬孢子的形态。

2.2 病原菌分子学鉴定

2.2.1 病原菌总DNA的提取

DNA提取使用Omega公司的高纯真菌DNA提取试剂盒。

2.2.2 PCR扩增

锈菌ITS序列分析的PCR反应总体积为50 μL，其中2×phanta max ×Buffer 25 μL， dNTPs 1.0 μL，phanta 1.0 μL，引物 ITS1 和 ITS4 各 2 μL，ddH2O 18 μL，模板DNA（25 ng/uL）1 μL。每次反应均设立ddH2O阴性对照。扩增在ABI-PCR仪上进行。反应程序：95℃预变性 3 min；95℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃再延伸5 min；4℃保存；待PCR 结束后，取3 uL PCR 产物与2 uL 含有花青素的Loading-buffer（1 mL Loading buffer+10 uL 花青素）混合均匀，用1.5%的琼脂糖凝胶在120 V 下电泳45 min，切胶回收特异片段，克隆，测序后通过NCBI网站分析比对PCR产物。

2.2.3 序列分析与数据处理

PCR产物符合要求的通过胶回收后克隆测序，整理测序后的序列，在NCBI 网站中的BLAST 进行序列比对。

3 结果与分析

3.1 锈病发生情况

通过对西双版纳热带植物园的西区专类园区及东区部分园区锈病植物分布园区、发生期、盛发期、发病率、病情指数进行调查（表2）。调查结果显示，该区域内发生锈病的植物有14 种，分别是猪腰豆、黑叶小驳骨、美人蕉、野靛棵、鸡蛋花、木槿、香茅草、小驳骨、水菖蒲、思茅藤、灯油果、大驳骨、小粒咖啡、大粒咖啡。

表2 发生锈病植物分布及发病情况

从表2可以看出，发生期最长的是猪腰豆、美人蕉、思茅藤、灯油果、大粒咖啡，为全年发病；发病最严重的植物为猪腰豆，发病率高达100%，病情指数为52.50。发病植物的发病率从高到低依次为猪腰豆＞黑叶小驳骨＞美人蕉＞野靛棵＞鸡蛋花＞木槿＞大驳骨＞香茅草＞小驳骨＞菖蒲＞小粒咖啡＞大粒咖啡＞思茅藤＞灯油果；病情指数从高到低依次为猪腰豆＞野靛棵＞黑叶小驳骨＞鸡蛋花＞香茅草＞大驳骨＞木槿＞美人蕉＞小驳骨＞小粒咖啡＞菖蒲＞思茅藤＞大粒咖啡＞灯油果。

3.2 锈病症状及病原菌鉴定

对调查到的14种锈病植物依次描述发病特征，共鉴定出10种发病植物的病原菌（表3）。

表3 锈病症状描述及病原菌

（接上表）

从表3可以看出，小驳骨、黑叶小驳骨、大驳骨、野靛棵4种植物的发病症状相似，正面黄色突起圆斑，背面为凹陷红褐色近黑色颗粒状孢子堆；小粒咖啡和大粒咖啡发病症状相似，正面为黄褐不规则形圆斑，边缘有黄色晕圈，背面为黄色粉层。其他发病植物除猪腰豆、美人蕉、菖蒲在叶正面及背面均产生黄色、红褐色孢子堆外，其余植物如鸡蛋花、香茅草、思茅藤、灯油果、木槿均在叶背面产生黄色、红褐色、褐色孢子堆。小驳骨、黑叶小驳骨、大驳骨的病原菌为同一种，即裹篱樵柄锈菌(Puccinia thwaitesii)，小粒咖啡、大粒咖啡的病原菌为同一种，即驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）。

4 结论与讨论

本文对西双版纳热带植物园发生锈病植物进行调查及病原鉴定，明确发生锈病的植物种类、为害特征、园区分布、发生期及严重程度，共调查到该区域内发生锈病的植物有14 种。对每种发病植物的症状进行描述，同时将发病植物病原菌用形态学方法结合分子生物学方法进行鉴定，鉴定出10 种发病植物的病原菌。同时，调查中虽然发病植物鸡蛋花、美人蕉、猪腰豆在叶片上均产生黄色的孢子堆，通过形态学观察和分子学DNA鉴定，但是病原菌并不为同一种。而小粒咖啡和大粒咖啡的病原菌为同一种，黑叶小驳骨、小驳骨和大驳骨的病原菌为同一种，证实了同一种病原菌更容易侵染系统关系近的植物。虽然两者的病原菌为同一种，但发生期及盛发期却有所不同，且每种植物都有不同的发生期及盛发期。

在普查和定期观测中发现种植于野生食用蔬菜园的猪腰豆锈病全年发病且发病严重，而种植于藤本园的猪腰豆全年均未发病，这可能有3方面的原因。一是植物本身抗性，如树龄、树势和品种，如果树龄较老、树势较弱、品种易感病，则很容易遭受病原菌的入侵，植物就容易发病，如果树龄恰逢壮年期、树势强壮、品种为抗病品种，则病原菌很难入侵，植株就不发病。二是小环境，环境条件不仅分别影响着猪腰豆和锈菌，同时还影响着猪腰豆和锈菌之间的相互作用，当周围环境中的湿度、温度等利于猪腰豆生长而不利于锈菌生长，猪腰豆的抗病性增强，锈菌的致病性减弱，植株也不会发病，反之亦然。三是植物配置，如果猪腰豆锈病存在转主寄主，只要周围不种植转主寄主植物，猪腰豆则不发病，如果种植有转主寄主时，则会发病，在实际生产中可以通过清除转主寄主植物来减少锈病的发生与为害。