高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸的不确定度评定*

马义虔，陈学航，肖 洋，李清伟，张建刚

(贵州省产品质量检验检测院，贵州 贵阳 550016)

不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的非负参数(包括A类和B类不确定度)。A类可由贝塞尔公式法和极差法进行评定，B类可根据有关的信息或经验进行评定[1-3]。不确定度数值的大小反映了测量结果质量的高低。数值越小，所测结果与被测量的真值越接近，其使用价值就越高。在食品与化学分析、检测领域，评定不确定度既是提高分析检测质量的需要，也是实现检测结果国内外互认所不可缺少的内容。苯甲酸是一种常用的食品防腐剂，国家标准GB 2760-2014[4]规定了酱油中苯甲酸的最大使用量为1.0 g/kg。已有研究者评定了酱油、果汁泥和橘子汁中苯甲酸和山梨酸[5-8]不确定度，一方面未将不确定度的分量`考虑完整，另一方面不确定度有效位数保留不符合JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》规定，如果汁泥中苯甲酸含量为(5.997±0.746) μg/kg(k=2)[8]。本研究根据JJF 1059.1-2012[2]和JJF 1135-2005[3]，通过GB 5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》测定方法[9]评定酱油中苯甲酸的不确定度，以期为实验室质量控制、能力验证以及向社会出具官方检测报告提供科学、准确的根据。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

1260高效液相色谱仪(DAD)，美国Agilent公司；ME204E/02分析天平，瑞士Mettler公司；Allegra X-22R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；SB25-12DTS超声波清洗机，宁波新芝公司。

苯甲酸标准品溶液(浓度1 mg/mL)，中国计量科学研究院；亚铁氰化钾、乙酸锌均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸铵为优级纯，麦克林公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck公司；酱油为市售。

1.2 实验方法

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，样品前处理方法和色谱条件见GB 5009.28-2016[9]。

1.3 不确定度来源分析

1.3.1 不确定度模型

酱油中苯甲酸含量计算公式如下：

(1)

式中：X样品中苯甲酸含量，g/kg；C样品中苯甲酸的质量浓度，mg/L；V样品定容体积，mL；m样品质量，g；1000为mg/kg转换为g/kg的换算因子。

1.3.2 不确定度来源确定

图1 高效液相色谱测定酱油中苯甲酸的不确定度来源Fig.1 Uncertainty source for determination of benzoic acid in soy sauce with HPLC

2 结果与分析

2.1 测量重复性的不确定度

测量重复性的不确定度可通过样品重复进样来计算，属于A类不确定度评定。对酱油中苯甲酸进行10次重复测定，测定结果及不确定度见表1。

表1 酱油中苯甲酸重复测定结果及不确定度Table 1 Repeated determination of benzoic acid in soy sauce and its uncertainty

2.2 样品称量的不确定度μ(m)

天平重复性的标准不确定度：

(2)

天平示值的标准不确定度：

(3)

则样品称量的相对标准不确定度：

(4)

2.3 样品溶液定容体积的不确定度μ(V)

样品溶液定容体积的不确定度有：容量瓶允许差和温度效应。

2.3.1 容量瓶允许差的不确定度μ(V1)

(5)

2.3.2 温度效应的不确定度μ(T1)

(6)

则样品溶液定容体积的相对标准不确定度：

(7)

2.4 标准系列溶液配制的不确定度μ(std)

标准系列溶液配制的不确定度有两个部分：标准品和配制中量器(移液器允许差、容量瓶允许差和温度效应)。

2.4.1 标准品溶液的相对标准不确定度μrel(std)

苯甲酸标准物质购自中国计量科学研究院，根据证书提供的信息，相对扩展不确定度U=2%，K=2。因此，苯甲酸标准品溶液的相对标准不确定度：

(8)

2.4.2 标准系列溶液配制中量器的相对标准不确定度μ(V2)

(9)

(10)

标准系列溶液配制中量器的不确定度如表2所示。

表2 标准系列溶液配制中量器的不确定度结果Table 2 Uncertainty results by the measurer in standard series solution preparation

则由标准系列溶液配制的相对标准不确定度：

(11)

2.5 标准曲线拟合的不确定度μ(C)

标准曲线拟合的不确定度可通过HPLC依次测定1、5、10、20、50、100、200 mg/L的苯甲酸标准品溶液，用最小二乘法拟合标准溶液浓度-峰面积，得到峰面积和标准溶液浓度的线性方程，测定结果和不确定度见表3。

表3 标准标曲线拟合的不确定度Table 3 Uncertainty results introduced standard curve fitting

标准曲线拟合的不确定度可按(12)和(13)式计算：

(12)

(13)

2.6 回收率的不确定度μ(Rec)

受人员操作、实验室环境等因素影响，样品经处理后目标物苯甲酸会有一定损失。采用高、中、低3个水平添加苯甲酸标准品溶液进行回收率实验，每个水平进行3次测定，根据9次结果进行计算，回收率结果见表4。

表4 回收率测定结果Table 4 Results of recovery

回收率的不确定度属于A类不确定度评定，n=9，则回收率的相对标准不确定度：

(14)

2.7 液相色谱仪测定的不确定度μ(Dete)

(15)

2.8 合成相对标准不确定度

相对标准不确定度来源和各分量结果见表5。

表5 相对标准不确定度分量Table 5 List of relative standard uncertainties

合成相对标准不确定度：

=0.01922

(16)

2.9 不确定度报告及结果表示

表6 酱油中苯甲酸的不确定度评定报告Table 6 Uncertainty evaluation for the determination of benzoic acid in soy sauce

3 结 论

完整的测量数据应包括不确定度信息。不确定度测量可提供分析测定过程中误差来源。本文根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》和JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》标准和不确定度文献，结合本研究采用高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸的不确定度评定，按照实验顺序依次筛选出不确定度的来源包括测量重复性、称量、定容、标准溶液配制、液相色谱测定等过程。根据计算出各步骤的相对标准不确定度分量值，可得知标准系列溶液配制产生的不确定贡献最大，与宁宵等[12]、曹玲等[13]和潘城等[14]研究结果一致，其次是回收率和标准曲线拟合。因此，在实际操作过程中，应选择准确度等级较高的标准品和量器(玻璃量器和移液器)来配制标准系列溶液，使样品浓度介于第二和第三个标准点之间；保持高效液相色谱仪器较高的灵敏度；增加标准系列溶液和样品的测定次数；提高操作人员的分析测量水平以减小测量不确定度，从而提高数据结果的准确性。