热处理对鱼肌原纤维蛋白结构及腥味物质结合能力的影响

徐永霞 王 瑞 李学鹏 赵洪雷 仪淑敏 励建荣

（渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁锦州121013）

我国是淡水鱼加工大国，鲢鱼和鳙鱼等大宗淡水鱼产量高，且价格低廉，是生产鱼糜制品的良好原料。然而，与海水鱼鱼糜相比，淡水鱼鱼糜存在腥味重，凝胶特性差的问题[1]，并且特殊鱼腥味的存在一直是制约我国淡水鱼鱼糜加工产业发展的“瓶颈”。引起淡水鱼腥味的物质主要包括醛、酮、醇、含氮含硫类、烃类及萜烯衍生物等，在鱼肉贮藏期间及鱼糜加工过程中，微生物和酶的作用及脂肪氧化是鱼腥味产生的重要原因[2-3]。有研究表明[2，4]，脂肪氧化降解产生的醛及烯醛类物质是引起淡水鱼腥味的主要物质，如己醛、辛醛、E-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛和（E，Z）-2，6-壬二烯醛等。

肌原纤维蛋白是鱼糜的主要组成成分，在鱼糜制品加工中具有非常重要的作用，直接影响产品的质地和保水性等。目前研究主要集中在肌原纤维蛋白的凝胶特性和冷冻变性等方面[5]，忽略了其对鱼糜制品风味品质的影响。肌原纤维蛋白占鱼肉蛋白质总量的50%～55%，是吸附挥发性风味物质的主要受体。挥发性风味物质与蛋白质之间的结合多为可逆结合，如疏水相互作用、氢键和离子键等，同时也包括醛与赖氨酸残基以及巯基等的共价结合[6]。风味物质与蛋白质之间的结合作用取决于风味物质与蛋白质的自身特性以及外界因素的影响，蛋白质的种类、浓度、构象，风味物质的种类、疏水性及分配系数等都会影响两者间的相互作用[7]，其中蛋白质构象改变会显著影响其风味吸附特性，任何能使蛋白质构象改变的理化因素如温度、pH 值及盐类等都会影响其与风味成分的相互作用。热处理是鱼糜制品加工过程中的关键步骤，加热会使肌肉蛋白发生凝胶化反应，同时对蛋白质的风味结合能力具有重要影响。研究表明，加热导致蛋白质结构展开和聚合，改变了蛋白质与气味物质的结合位点，进而影响蛋白质对气味物质的吸附能力[8-9]，然而，具体如何影响，目前尚不完全清楚。

鉴于此，本文以花鲢鱼为对象，选取鱼肉中4种典型的腥味物质（己醛、庚醛、辛醛和壬醛），利用顶空-气相色谱-质谱联用法，结合紫外、荧光和拉曼光谱等技术探究鱼糜一段式加热过程中鱼肌原纤维蛋白与腥味物质结合作用的变化，旨在为淡水鱼加工过程中腥味物质的调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活花鲢鱼，锦州市林西街水产市场，尾重600 g 左右。

己醛、庚醛、辛醛、壬醛均为色谱纯级，美国Sigma 公司：十二烷基磺酸钠（SDS）、尿素、β-巯基乙醇、5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ANS）、丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、溴酚蓝、甘氨酸等均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2550 紫外可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；970CR 荧光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；LabRAM HR Evolution 拉曼光谱仪，崛场（中国）贸易有限公司；全自动顶空进样器、7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取及蛋白液样品的制备参照Sun等[10]的提取方法，并略作修改。取新鲜花鲢鱼背部肌肉，绞碎后加入5 倍体积的Tris-HCl 溶液（10 mmol/L，pH 7.2），高速均质3 次，每次30 s，于4 ℃，4 500 r/min 条件下离心10 min，取沉淀重复上述操作1 次，将所得沉淀加入5 倍体积的Tris-HCl 溶液（10 mmol/L，pH 7.2，含0.1 mol/L NaCl），高速均质3 次，每次30 s，于4 ℃，4 800 r/min 条件下离心10 min，取沉淀加入5 倍体积的Tris-HCl 溶液（10 mmol/L，pH 7.2，含0.6 mol/L NaCl），高速均质3 次，每次30 s，于4 ℃，4 800 r/min 条件下离心15 min，收集上清液置于4℃保存备用。采用Lowry 法测定肌原纤维蛋白溶液质量浓度。

蛋白提取液在90 ℃下分别加热1，2，5，10，20，30 min，迅速冷却后用Tris-HCl 缓冲液（pH 7.2）调节至所需蛋白质质量浓度，在4 ℃下冷藏备用，以未加热蛋白液作为对照组。

1.3.2 腥味物质储备液的制备 将己醛、庚醛、辛醛、壬醛溶于10 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.2，0.6 mol/L NaCl）中，制得风味化合物最终质量浓度为2 000 mg/L，于4 ℃下储存。

1.3.3 浊度的测定 参考Wang等[11]的方法，将待测肌原纤维蛋白溶液的质量浓度调节到2 mg/mL，采用紫外分光光度计在波长350 nm 处测定吸光度，即为肌原纤维蛋白溶液的浊度。

1.3.4 总巯基含量测定 参照Yongsawatdigul等[12]的方法略作修改。蛋白液样品用Tris-HCl 缓冲液稀释到5 mg/mL 后，取1 mL 加入9 mL 50 mmol/L 的磷酸缓冲液（8 mol/L 尿素，0.6 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 7.0）中混匀。取4.5 mL上述混合液加入0.5 mL DTNB（10 mmol/L），避光反应30 min 后，在波长412 nm 处测定吸光度，巯基含量的计算公式如下：

T-SH（μmol/10-5g）=A·D×10/（C×ε）

式中，A——减去试剂空白后波长412 nm 处蛋白的吸光值；D——蛋白稀释倍数；C——蛋白质质量浓度，mg/mL；ε——巯基摩尔消光系数，13 600 L/（mol·cm）。

1.3.5 表面疏水性测定 参考Chelh等[13]的方法，采用ANS 荧光探针法测定蛋白液的表面疏水性。将蛋白液样品用Tris-HCl 溶液稀释到质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL 的溶液，加入50 μL的ANS（8 mmol/L），混匀后避光静置10 min，以0.6 mol/L NaCl-10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液作空白对照，然后用荧光分光光度计测定其荧光强度。测定条件为：激发波长374 nm，狭缝均为5 nm，扫描范围250～500 nm，灵敏度为2。结果以荧光强度与肌原纤维蛋白质量浓度对应曲线的斜率表示。

1.3.6 内源荧光测定 蛋白液样品用Tris-HCl 缓冲液调至质量浓度为0.25 mg/mL，采用荧光分光光度计测定内源荧光，测定条件为：激发波长295 nm，狭缝均为10 nm，扫描范围300～450 nm，灵敏度为2，测定时间为1 min。

1.3.7 拉曼光谱分析 蛋白液样品用Tris-HCl 缓冲液稀释到5 mg/mL 后冷冻干燥，采用拉曼光谱测定，条件为：激发波长785 nm，功率120 mW，曝光时间60 s，检测范围500～3 200 cm-1，每个样品扫描3 次。结果采用Labspec 软件对谱图进行基线校正和平滑处理，以苯丙氨酸的单基取代苯基环在1 003 cm-1伸缩振动强度作为内标进行归一化。

1.3.8 肌原纤维蛋白对腥味化合物结合能力的测定 参考Cao等[14]的方法并稍做修改。蛋白液样品用Tris-HCl 缓冲液调到质量浓度为5 mg/mL，取10 mL 样品加入20 mL 顶空瓶中，添加风味化合物储备液并调至质量浓度为1 mg/L，密封摇匀，置于30 ℃恒温振荡吸附1 h 后，样品采用顶空进样结合GC-MS 法测定各挥发性风味物质的顶空浓度。空白组用相同体积的Tris-HCl 缓冲液替代蛋白液样品。

GC 条件为HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为99.999%的高纯氦气，流速1.0 mL/min，不分流模式进样，解析时间5 min，进样口温度250 ℃；升温程序：柱初温40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min 程序升温到100 ℃，保持5 min。

MS 条件为色谱-质谱传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；离子化方式：EI；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 30～550。

肌原纤维蛋白对腥味物质的结合能力用相对结合百分比（%）来表示：

1.4 数据分析

每组试验皆重复3 次，使用SPSS 20.0 软件进行显著性分析，利用Excel 2010 和Origin 9.0制作表格和绘图。风味成分采用NIST11/Wiley7.0标准质谱库进行定性，通过峰面积归一化进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 肌原纤维蛋白浊度的变化

浊度反映了溶液中可溶性悬浮粒子的大小和数量，可以用来表征蛋白质的聚集变性程度[15]。热处理使肌原纤维蛋白发生变性，导致蛋白分子内部结构展开以及大量疏水基团暴露，使得蛋白质分子间可通过疏水作用相互聚集，形成各种聚集体。当蛋白质展开速率大于聚集速率时，形成颗粒较小的聚集体，不易沉降，蛋白聚集后溶液中悬浮颗粒逐渐增大，使光散射增强，浊度增加；当展开速率低于聚集速率时，则形成较大颗粒的蛋白聚集体，易沉淀，导致光散射降低，浊度下降[16]。在90 ℃热处理过程中肌原纤维蛋白溶液浊度的变化如图1所示。由图1可知，随着加热时间的增加，肌原纤维蛋白溶液的浊度呈显著增加的趋势（P<0.05），加热时间在20 min 左右时溶液的浊度达到最大值；当加热时间超过20 min 后，肌原纤维蛋白在悬浊液中形成较大颗粒的聚集体而沉淀，使光散射降低，因此浊度又开始下降。

2.2 肌原纤维蛋白表面疏水性的变化

表面疏水性是表征蛋白质表面与外界极性水环境接触的疏水性残基数量的重要指标，能反映蛋白质分子微观结构的变化，可用来评价蛋白质的变性情况。加热过程中肌原纤维蛋白表面疏水性的变化如图2所示。由图2可知，随着加热时间的延长，肌原纤维蛋白的表面疏水性显著增加（P<0.05），并在加热20 min 时达到最大值，这是由于蛋白质的热变性使蛋白分子结构展开，内部疏水基团暴露，引起肌原纤维蛋白分子去折叠，同时热处理还会诱导蛋白质表面特殊氨基酸残基的出现，使得蛋白质表面疏水性增加[17]；随着加热时间的进一步延长，肌原纤维蛋白表面疏水性出现显著下降趋势（P<0.05），可能是由于加热过程中肌原纤维蛋白通过疏水相互作用聚集形成蛋白质聚集物-簇，将暴露的少量疏水性残基重新包埋于蛋白质内部，从而使表面疏水性下降[18]。此结果与Promeyrat等[19]研究热处理对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响结果相似。

2.3 肌原纤维蛋白总巯基含量的变化

巯基是稳定蛋白质结构的重要基团，同时也是蛋白质中反应活性最强的功能性基团之一。总巯基主要包括活性巯基和隐藏在蛋白分子内部的巯基，总巯基含量的变化可以反映二硫键的形成情况[20]。由图3可知，肌原纤维蛋白总巯基含量随加热时间的延长呈先增加后降低的趋势（P<0.05），并在加热10 min 时达到最大值。加热初期总巯基含量上升可能是因为蛋白质受热变性，蛋白分子结构伸展，使埋藏在内部的巯基基团暴露于蛋白质分子表面。随着热处理时间的进一步延长，肌原纤维蛋白总巯基含量显著降低（P<0.05），一方面可能是由于加热过程中暴露的巯基被氧化形成了二硫键，另一方面可能是加热使肌原纤维蛋白变性形成聚集体，将之前暴露出巯基重新包裹，从而使得总巯基含量下降[21]。本试验结果表明，热处理过程中肌原纤维蛋白分子先伸展后逐渐聚合，并且聚合程度随热处理时间的增加逐渐增强。

图1 热处理过程中肌原纤维蛋白浊度的变化Fig.1 Changes in the turbidity of myofibrillar proteins during heating treatment

2.4 肌原纤维蛋白内源荧光的变化

内源荧光主要反映蛋白质分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基的荧光特性及所处环境的变化情况，进而可用来表征蛋白分子结构的变化[22]。90 ℃加热不同时间（0，5，10，15，20，25，30 min）肌原纤维蛋白的荧光光谱如图4所示。由图4可知，随着热处理时间的增加，肌原纤维蛋白的内源荧光强度逐渐降低，产生荧光猝灭现象，峰位置发生红移，表明热处理使蛋白质的空间结构发生明显改变。当加热时间在1～5 min范围内，肌原纤维蛋白的荧光强度差异较小，峰位置未出现明显移动，表明此加热时间范围内蛋白的空间构象变化不明显；当加热时间继续增加，荧光淬灭显著，峰位置发生明显的红移，表明内部疏水基团暴露[16]。肌原纤维蛋白热变性过程中，结构逐步展开，使埋藏在分子内部的色氨酸等芳香族氨基酸残基暴露，导致肌原纤维蛋白所处微环境极性增强，产生溶剂猝灭作用，从而使得蛋白质内源荧光强度不断降低[16]。

图2 热处理过程中肌原纤维蛋白表面疏水性的变化Fig.2 Changes in the surface hydrophobicity of myofibrillar proteins during heating treatment

图3 热处理过程中肌原纤维蛋白总巯基含量的变化Fig.3 Changes in the total sulphydryl content of myofibrillar proteins during heating treatment

图4 热处理过程中肌原纤维蛋白内源荧光的变化Fig.4 Changes in the intrinsic fluorescence of myofibrillar proteins during heating treatment

2.5 肌原纤维蛋白二级结构的变化

蛋白质二级结构是指多肽链的部分氨基酸残基呈周期性、有规则的空间排列，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构，其中α-螺旋结构反映蛋白质分子的致密性，而β-折叠和β-转角等结构则反映蛋白分子的松散性[23-24]。肌原纤维蛋白在不同加热时间下的拉曼光谱和二级结构相对含量的变化如图5所示。可以看出，加热0～5 min内，α-螺旋含量显著下降（P<0.05），由65.36%下降至37.69%，与此同时，β-折叠和β-转角的含量显著增加（P<0.05），分别由16.98%和10.11%增加至37.23%和18.06%，无规则卷曲含量也有所增加但无显著性差异（P>0.05）；随着加热时间的延长，α-螺旋含量显著上升，而β-折叠和β-转角含量逐渐下降，无规则卷曲含量无显著变化，这与Han等[25]研究加热过程中肌球蛋白二级结构的变化结果相似。蛋白质二级结构的稳定性主要依靠氢键、疏水相互作用、静电相互作用等非共价键力，其中α-螺旋结构的稳定性主要来自多肽链上羰基（C=O）和氨基（-NH）之间的链内氢键作用。加热导致蛋白质变性，使得羰基和氨基间的氢键作用被破坏，α-螺旋结构逐渐解旋，可能转变成β-折叠和β-转角结构。而加热后期，水分随二级结构的展开发生相应转移，为疏水性基团和巯基的暴露提供了更大的空间。此时蛋白质逐渐聚合，同时β-折叠等结构开始分解，通过分子间疏水相互作用形成α-螺旋，从而使α-螺旋含量回升。因此，热处理过程中肌原纤维蛋白的二级结构处于不断变化中，可能是在熵的驱动下导致α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲之间的相互转化[26]。

图5 热处理过程中肌原纤维蛋白拉曼光谱（a）和二级结构相对含量的变化（b）Fig.5 Changes in the Raman spectrum（a）and relative content of secondary structures（b）of myofibrillar protein during heating treatment

2.6 肌原纤维蛋白结合能力的变化

蛋白质的构象决定其风味吸附能力，热处理能显著改变蛋白质的构象，从而影响风味的吸附与释放[10]。热处理过程中肌原纤维蛋白对4种典型腥味物质（己醛、庚醛、辛醛和壬醛）结合能力的变化情况如图6所示。由图6可知，未经加热的蛋白质对己醛、庚醛、辛醛和壬醛的结合能力分别为15.636%，13.749%，20.319%，21.282%，说明其相互结合能力随着碳链的增长而增加，这可能是由于碳链长的醛类拥有更多的结合位点，从而与蛋白质的结合能力更强。Wang等[9]也有相似的研究结果。随着热处理时间的延长，肌原纤维蛋白对4种醛类的吸附能力均呈先增强后下降的趋势，其中对己醛、庚醛和壬醛的吸附能力均在加热5 min时达到最大值，分别为27.45%，36.82%，48.58%，对辛醛的吸附能力则是在2 min 达到最大值46.02%；随着加热时间的延长，肌原纤维蛋白对4种醛类的吸附能力显著减弱。由此可见，热处理对肌原纤维蛋白与4种饱和醛类化合物的结合作用影响显著。有学者指出，醛类化合物与蛋白质之间主要通过疏水相互作用、氢键等可逆结合，同时也与蛋白质中赖氨酸残基、巯基等通过共价键结合，而加热导致蛋白质变性，使蛋白质的结构、疏水性等发生改变，进而影响其与风味物质的结合能力[27]。加热过程中蛋白质结构伸展，使埋藏于折叠结构内部的作用位点、疏水区域暴露出来，使风味物质与蛋白质之间的共价结合或疏水相互作用增强，从而使两者之间的结合能力增强[28]；同时，疏水性残基的暴露也可能导致蛋白质与蛋白质之间的作用增强，取代了蛋白质与风味化合物之间的相互作用，从而使两者之间的结合能力减弱[10，27]。因此，在加热初期，随着肌原纤维蛋白结构展开，蛋白质内部疏水性基团及巯基基团暴露，增加或改变了特异性结合位点，从而导致肌原纤维蛋白与醛类物质的结合能力增强；随着加热时间的增加，蛋白质与蛋白质之间的相互作用增强，形成聚集体沉降，使原先暴露的疏水性结合位点重新被包埋，导致蛋白质的风味吸附位点数量减少，从而减弱其对醛类风味物质的结合能力。

图6 热处理过程中腥味物质与肌原纤维蛋白结合能力的变化Fig.6 Changes in binding capacity of fishy odor compounds to myofibrillar protein during heating treatment

3 结论

本试验研究了鱼糜一段式加热过程对鱼肌原纤维蛋白与醛类特征腥味物质结合作用的影响。结果表明，随着热处理时间的增加，肌原纤维蛋白的浊度、表面疏水性和总巯基含量呈先增加后降低的趋势，内源荧光强度逐渐下降；加热时间在0～5 min 范围内，α-螺旋含量显著下降，由65.36%下降至37.69%，而β-折叠和β-转角的含量显著增加，当加热时间超过5 min 后，α-螺旋含量又逐渐升高，β-折叠降低；肌原纤维蛋白对4种醛类腥味物质的结合能力随加热时间的延长先增强后减弱，其中对己醛、庚醛和壬醛的结合能力均在加热5 min 时达到最大值，分别为27.45%，36.82%，48.58%，而对辛醛的结合能力在2 min 达到最大值，为46.02%。热处理过程中，肌原纤维蛋白对醛类腥味物质的结合能力增强与减弱，可能是由于蛋白质结构展开与聚合过程中暴露或改变风味结合位点所致。