基于原子力显微图像和流变学特性的大豆种皮多糖构象分析

张红运 杨立娜 朱丹实 刘 贺*

（1 渤海大学食品科学技术学院 国家和地方新鲜农产品和水产品存储加工和安全控制技术联合工程研究中心辽宁锦州121013 2 上海理工大学医学仪器与食品工程学院 上海食品微生物工程研究中心 上海200093）

大豆种皮多糖（Soybean hull polysaccharide，SHP）是从大豆种皮中提取纯化的一种酸性多糖，前期试验表明其主要由半乳糖醛酸组成，包含少量鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其重均分子质量304 638 u，数均分子质量170 795 u。大豆种皮多糖的红外光谱除有一般糖的吸收峰外，在1 743 cm-1和1 614 cm-1处显示有糖醛酸羧基及其羧酸盐的吸收峰，并且刚果红试验表明该多糖在盐溶液中存在螺旋构象。

多糖的生物活性除受多糖链的溶解性、化学组成、分子质量等理化特征影响外，还受糖链构象的影响[1-3]。多糖链的构象主要与链结构、分子内和分子间作用力以及溶剂有关。多糖分子的作用力主要包括氢键、偶极相互作用、疏水力和静电力等非共价作用力[4]。外界条件（如热处理、超声波、pH值的变化、金属离子和溶剂）的改变也会引起多糖在溶液中构象改变[5]。了解多糖的构象可以更好地阐明其结构与功能的关系。

由于多糖的相对分子质量大，结构复杂，自身常存在结构缺陷，无法得到良好的晶形，因此难以开展对其二维结构的研究。原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）是近十几年在扫描隧道显微镜基础上发展起来的研究生物大分子形态和构象的物质结构分析仪器。生物大分子在其生理环境下直接成像，可观察分子构象的变化并提供生物大分子纳米及亚微米级的三维结构信息，被广泛用于研究多糖等生物大分子的表面形貌或结构[6-7]。莫开菊等[8]利用原子力显微镜发现葛仙米多糖存在柔性和刚性2种形态的支链，并存在单螺旋构象。为了得到清晰、稳定的AFM 图像，一般设置AFM 针尖作用力3～4 nN，从而确保糖链的完整形态不被破坏[9]。

多糖溶液可通过分子间非共价键，如氢键、疏水作用、静电作用、范德华力和离子键形成网络交联的凝胶结构。流变学作为研究物质流动和形变的科学，不仅能直接反映物质的宏观力学性质，而且能提供流体黏弹性等丰富的微观结构变化信息[10]。杨慧娇等[11]采用凝胶渗透色谱和流变仪发现水溶性大豆多糖在水溶液中呈紧密的无规则线团构象，具有很低的本征黏度并表现出很强的剪切变稀行为。

本文研究分为2 部分：第1 部分，采用AFM观察不同质量浓度和离子强度的大豆种皮多糖在水溶液-云母片表面的微观形貌，获得更多该多糖的分子结构特征信息。第2 部分是通过流变学数据研究SHP 在不同环境条件下力学性质的变化。本研究可为深入探究SHP 分子结构与生物活性关系提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

大豆种皮，购自锦州大豆皮经销公司；DEAE琼脂糖凝胶FF、葡聚糖凝胶G100，华迈科公司；透析袋（截留分子质量7 000 u），美国3M 公司；其它试剂均为分析纯级。

XE-70 型原子力显微镜，韩国Park Systems公司；DHR-1 流变仪，美国TA 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆种皮多糖的制备与纯化 大豆种皮经草酸铵提取，乙醇沉淀，热风干燥得到粗多糖。粗多糖再经DEAE 琼脂糖凝胶FF 离子交换层析和葡聚糖凝胶G100 层析，透析，真空冷冻干燥制得纯多糖，经高效液相色谱鉴定为单一对称峰，确定为均一组分。

1.2.2 AFM 分析用多糖溶液的制备 准确称取10 mg 大豆种皮多糖，溶解在10 mL 超纯水中，配制成1 mg/mL 的多糖溶液。在磁力搅拌器上搅拌12 h，使其充分溶解。用超纯水稀释成0.01，1，5 μg/mL 的多糖溶液，在85 ℃加热10 min，0.45 μm滤膜过滤。

采用相同的制备方法制备终浓度为0.5 mol/L的多糖KCl 溶液，进行大豆种皮多糖的AFM 图像测定。

1.2.3 AFM 样本的制备及参数设置 用移液器吸取5 μL SHP 溶液滴加在新切割的云母片表面，在培养皿中自然干燥，待样片干燥后即可进行AFM 测量。

AFM 参数设置：扫描范围1.000 μm×l.000 μm，扫描频率1.001 Hz，针尖为硅，湿度45%～60%，微悬臂长235 μm，弹性参数98 N/m。

1.2.4 稳态流变分析 采用DHR-1 流变仪检测质量浓度为5，10，15，20，25，30 mg/mL SHP 溶液的流变特性。分别取1.5 mL 乳状液，采用40 mm平行板夹具，狭缝距离设置为0.5 mm，剪切速率0～100 s-1，于25 ℃条件下检测。

采用相同的程序，测定终浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mol/L KCl 的5 mg/mL SHP 溶液的流变特性。

1.3 数据统计分析

采用Park Systems XE-70 型原子力显微镜自带软件处理AFM 图，并通过Origin 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 大豆种皮多糖在水溶液中的AFM 图像

采用液滴沉积技术将多糖溶液滴加于云母片表面，并通过AFM 观察获得多糖链的结构信息。然而，由于云母片对多糖的亲和力较差，导致多糖在云母片表面排列的异质性（图1）。AFM 图像显示多糖链在某些区域的外围呈分散的网状结构；而在区域中心，由于多糖链分散性差导致其呈严重的重叠核状体结构。Balnois等[12]的研究发现琥珀聚糖的AFM 图像也反映出相同的现象，在制片干燥过程中琥珀聚糖的流失会导致其结构呈密度分布不均的柔性单链及重叠区刚性链现象。因此，可通过加热分散样品或MgCl2孵育云母片的方法消除样品及云母片表面静电斥力的干扰，避免样品在云母片表面重叠聚集。

图1 大豆种皮多糖（5 μg/mL）AFM 图像Fig.1 AFM image of SHP at a mass concentration of 5 μg/mL

AFM 图像所示多糖分子的密度取决于其初始质量浓度及其沉积到云母片表面的多糖分子的量。将不同质量浓度的大豆种皮多糖样品分别用AFM 成像观察，可得到云母片表面多糖分子的不同形貌信息。

2.1.1 5 μg/mL 大豆种皮多糖的AFM 图像 图2为5 μg/mL 大豆种皮多糖的平面图和相对应的三维立体图像。如图所示，当质量浓度为5 μg/mL时，SHP 在云母片表面呈密集的条带状结构，链条的高度为0.997～8.213 nm。在立体图（图2b）上可清楚地观察到粗细2种不同形态的多糖链结构，并且其具有不同的高度值。图2b 中细链条呈无规则蠕虫状弯曲结构，具有一定的柔韧性，其高度为0.597～2.328 nm。通常来说，多糖分子的单链高度一般为0.1～1.0 nm，因此推测图2 中细链条是由单条链或多条链通过分子间氢键互相缠结或通过链间缔合形成的紧密螺旋体结构。由于多糖质量浓度大，羟基数目多，使得分子间氢键缔合作用增强，多糖链间聚合堆积而形成点状或棒状结构，从而能在AFM 图像上观察到高度接近8 nm 的多糖链聚集体。Balnois等[12]发现阴离子细菌多糖——琥珀酰聚糖（10 μg/mL）在云母片上也呈链条状的表面结构，并且直径在563～770 nm 范围内，高度在0.32～0.64 nm 之间。

图2 大豆种皮多糖（5 μg/mL）AFM 图像Fig.2 AFM images of SHP at a mass concentration of 5 μg/mL

2.1.2 1 μg/mL 大豆种皮多糖的AFM 图像 随着质量浓度降低，大豆种皮多糖的形貌发生了变化。如图3所示，多糖质量浓度为1 μg/mL 时，由于糖链密度降低，聚集体逐渐打开呈分散的交叉粘连的网状结构，表面高度为1.348～3.948 nm，交联圆环直径大小不等，如47，58，86，337 nm等，推测其为具有多分支的多糖结构。

图3 大豆种皮多糖（1 μg/mL）AFM 图像Fig.3 AFM images of SHP at a mass concentration of 1 μg/mL

在多糖质量浓度较低的条件下，多糖分子之间仍然发生了交联。这是由于柔性多糖分子具有更复杂的结构，通常含有支链和非碳取代基团，导致它们之间可通过糖链上的阴离子与阳离子相互作用，分子内和分子间的氢键或者范德华力相互作用产生交联[13-14]，并且云母片表面对多糖的斥力也对其形貌有一定影响。因此，柔性多糖分子在水溶液中很容易发生链间交联[15]。

2.1.3 0.01 μg/mL 大豆种皮多糖的AFM 图像 当多糖质量浓度为0.01 μg/mL 时，聚集体逐渐分散成细链条状结构。在AFM 图中，由于针尖的尺寸偏大容易导致“增宽效应”，使测定的宽度值偏大，所以糖链直径通常以其链高度表示。通过取点统计，图4a1 和4b1 的糖链高度为1～8 nm，并且集中分布在2～4 nm，表明该质量浓度的多糖溶液存在糖链间的螺旋构型。图4a2 和4b2 存在一条圆圈状、一条长链状的多糖链。其中，圆圈状多糖的周长约为5.168 μm，高约1.004 nm；长链多糖长2.41 μm，宽0.597 nm，高为0.563 nm 或0.997 nm，边缘与链中心高度的差异表明该结构是由2 条多糖链相关交联形成的二聚体。事实上，在一些情况下，糖链可通过沿链条观测到的高度差异（“柔性”部分：0.563 nm，“刚性”部分：0.997 nm；）判断多糖链的刚性和柔性2种状态。由于2 条链长度不存在数量级差别，具有一定的可信性，并且符合多糖单链直径的理论值（0.1～1 nm），因此推测多糖链为双链部分缠绕结构。

AFM 图像中的二聚体可能是由于加热处理的温度达到了Tm 值以及干燥时的局部浓度增加导致糖链构象发生由线圈状到螺旋状的转换，并导致链内或链间相互作用加强。类似的二聚体链高度的双重性也表明其刚性链是由无序的柔性链构象过度而成的有序的螺旋结构。由此推断，高浓度下，SHP 在水溶液中以聚集体的形式存在，随着浓度降低，分子间距离增大，多糖以单链或双链形式存在。

图4 大豆种皮多糖（0.01 μg/mL）AFM 图像Fig.4 AFM images of SHP at a mass concentration of 0.01 μg/mL

图5 大豆种皮多糖（0.01 μg/mL）高度分布柱状图Fig.5 Histogram of the height distribution of SHP of 0.01 μg/mL

2.2 0.5 mol/L KCl 溶液中大豆种皮多糖的AFM 图像

2.2.1 0.5 mol/L KCl 溶液中5 μg/mL 大豆种皮多糖的AFM 图像 在0.5 mol/L KCl 溶液中，多糖大分子在云母片表面相互聚集形成凝胶网状结构，高度在1.052～2.745 nm 范围内。图6a 中白色圆锥形结构为KCl 晶体。在质量浓度较高的盐溶液中，多糖结构与以水作为分散剂的多糖结构显著不同。以水作为分散剂时，即使未经过滤，多糖溶液也没有观察到凝胶形成。

当多糖溶液的质量浓度为5 μg/mL 时，单个分子的分子链及其多个侧支链结构相互缠绕形成聚合物，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生出许多环或带有分支的侧链结构，环的尺寸在45.61～367.94 nm 范围内，从而直接证实多糖大分子具有高度分枝的化学结构。单链宽度为26.61～53.71 nm；高度为1.05～2.75 nm，大于单链分子的估算值，说明每股并非为单个糖链。

多糖分子链之间交联成网状结构的现象也曾被报道过，刘荣华等[16]将绞股蓝多糖GPPⅢ-a（10 μg/mL）经45 ℃水浴加热后于AFM 上观察，发现聚合物链分子间互相缠绕，交联形成许多大小不一的不规则环状结构。

因为盐的存在，AFM 尖端对云母片的作用力会降低，同时对多糖聚合物的相互作用也会产生一定的影响，因此在纳米尺寸范围的数据测量难以校准。综上所述，AFM 数据仅由少数被测量的大分子数据组成，其存在比较大的标准偏差。

图6 0.5 mol/L KCl 溶液中大豆种皮多糖（5 μg/mL）AFM 图像Fig.6 AFM image of SHP at a mass concentration of 5 μg/mL in 0.5 mol/L KCl

2.2.2 0.5 mol/L KCl 溶液中不同质量浓度大豆种皮多糖的AFM 图像 由图7可知，随着多糖质量浓度逐渐降低，多糖分子形貌出现显著变化。多糖链从紧密排列的交联网状结构（图7a1）逐渐分散成短棒状结构（图7a2）。KCl 诱导的多糖构象的凝胶化归因于糖链交界区交联的形成，K+与多糖中的半乳糖醛酸基团螯合，形成具有分支的网状交联[17]。

图7a1可观察到多糖链的紧密度增加，多个分子链及其侧枝结构间以及分子内的缠绕和螺旋。研究表明多糖分子间存在螺旋（有序）和线圈（无序）间的可逆热转换，且螺旋结构在低温和高离子强度下稳定。Morris等[17]研究发现，多糖分子间存在螺旋（有序）和线圈（无序）间的可逆热转换，且螺旋结构在低温和高离子强度下稳定。图7a2可明显观察到多糖卷曲螺旋的短棒状构象。多糖质量浓度的降低导致链间距离增大，分子网状交联弱化，转而形成少数分子间的紧密作用，短棒状结构的产生说明高离子强度可导致自身无规则组装。这可能是由于负电荷的静电排斥，云母片和大豆种皮多糖中半乳糖醛酸侧链基团压倒其吸附力所致。由刚果红试验表明，多糖在不同溶剂条件下存在螺旋与解螺旋的构象转变现象，对比水溶液的原子力采集的图像，验证了多糖存在自我螺旋以及紧密度增加的构象转变现象。

图7b2 中所显示的盘绕股长为83.29～123.46 nm，宽为17.48～20.32 nm，高为0.84～1.348 nm，说明每股为单个糖链且产生自螺旋现象。由于红外光谱3 300～3 400 cm-1处来源于缔合氢键，考虑到该多糖化合物的糖醛酸含量比较高，因此认为1个糖链上的糖醛酸羧基或羧基负离子上的强电负性氧原子与另1 个糖链上的羟基氢易形成分子间氢键，最终形成糖链缠绕成股的情况，提示多糖在结构上可能存在类似蛋白质的自组装现象。

图7 0.5 mol/L KCl 溶液中大豆种皮多糖（5 μg/mL，0.01 μg/mL）AFM 图像Fig.7 AFM image of SHP at a mass concentration of 5 μg/mL and 0.01 μg/mL in 0.5 mol/L KCl

2.3 流变学性质分析

2.3.1 不同质量浓度SHP 溶液的稳态流变 由图8可知，随着剪切速率的增加，体系黏度逐渐减小，表现出剪切稀化现象。剪切速率的增加会破坏SHP 形成的网状结构，释放出包裹的水分使黏度下降，当剪切速率增加到一定程度时，黏度逐渐趋于稳定。

利用牛顿幂律方程y=Kxn进行模型拟合，得到各自的K 值和n 值，结果见表1。式中：y——剪切应力，Pa；x——剪切速率，s-1；K——稠度系数，代表剪切速率为1 s-1时的液体黏度，mPa·sn；n——流动特性指数，其大小表示液体偏离牛顿流体的程度。当y 和x 为线性增长关系即n=1 时，该溶液为牛顿流体；当y 和x 为非线性增长关系时，溶液为非牛顿流体[18]。

表1 中所有样品的决定系数R2≥0.99，说明幂律模型回归具有很好的拟合度，流动特性指数（n）说明溶液属于假塑性流体（n＜1）。随着多糖质量浓度的增加，SHP 溶液黏度增大，稠度系数（K）显著增大，流动特性指数（n）逐渐减小，即随着SHP 浓度的增加，单位面积内的分子增多，导致溶液的流动性下降，并且假塑性流体行为越来越明显。这是因为随着SHP 质量浓度的增加，单位区域的多糖分子增多，糖链密度增大，分子间氢键以及范德华力增强，流动阻力增强，系统水分活度降低，从而表现出黏性增强。

2.3.2 添加不同浓度KCl 的SHP 溶液的稳态流变 由图9可知，溶液表现出剪切稀化现象，且SHP 溶液的黏度随着KCl 浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，0.6 mol/L KCl 处理下的SHP 溶液表现出最大的黏度。随着KCl 浓度进一步提高，溶液的黏度呈现降低的趋势，这是因为SHP是由中性糖及酸性糖组成，结构较为复杂，添加低浓度的KCl 溶液可以降低多糖链之间静电斥力，形成一定数量的氢键，呈现出黏度升高的趋势，而添加高浓度的KCl 溶液会对多糖分子产生静电屏蔽作用，导致其自身溶胀度降低，分子间交联度减小，分子间作用力减弱，从而降低了溶液体系的黏度。

图8 剪切速率对不同浓度SHP 溶液黏度的影响Fig.8 Effects of shear rate on viscosity of SHP with different concentrations

图9 剪切速率对添加不同浓度KCl 的SHP溶液黏度的影响Fig.9 Effects of shear rate on viscosity of SHP at different concentrations of KCl

表1 不同质量浓度SHP 下稳态流变的幂率方程拟合参数Table 1 Power law equation fitting parameters of different mass concentrations of SHP static rheological curve

表2 不同浓度KCl 的5% SHP 溶液稳态流变的幂率方程拟合参数Table 2 Power law equation fitting parameters of 5%SHP static rheological curve at different concentrations of KCl

利用牛顿幂律方程y=Kxn进行模型拟合，结果见表2。表2 中所有样品的决定系数R2≥0.95，说明幂律模型回归具有很好的拟合度。通过对比稠度系数（K）可以看出，未添加KCl 的5% SHP溶液K 值最大，添加KCl 的SHP 溶液K 值呈现先升高后降低的趋势。其中，试验组中添加0.6 mol/L KCl 的SHP 溶液K 值最大（K=0.32），流动特性指数（n）随着KCl 的添加浓度的增加呈现逐渐减小的趋势。综合表2 信息发现，KCl 处理后的多糖呈现出稠度系数下降，流动指数降低，而表观黏度和应力升高的现象，该现象说明KCl 的加入可能导致溶液体系逐渐从流体状态转变为弱凝胶状态，这可能是由于KCl 的加入导致多糖分子糖链之间的疏水作用增强，交联度增加，体系形成网状结构状态。该结果可以很好的印证原子力显微镜的观测结果。

3 结论

大豆种皮多糖的AFM 成像因为受质量浓度及离子强度的影响，所以呈现不同的分子聚集行为的图像。高质量浓度的SHP 溶液存在棒状刚性链和蠕虫状柔性链2种构型，质量浓度的降低导致多糖分子间的作用力减弱，多糖分子间分散性增强，可由紧密堆积的条带状分子链结构逐渐打开转变为交叉粘连的网状结构及符合多糖单链直径理论值的2 条单链局部缠绕的双链结构。

离子强度对大豆种皮多糖的影响体现在多糖的螺旋紧密度上，大豆种皮多糖在云母片表面呈现伸展的柔性长链，而在0.5 mol/L KCl 溶液处理下相互聚集形成凝胶网状结构，通过降低多糖质量浓度，溶液进一步分散呈现螺旋刚性短棒状结构，说明KCl 盐溶液可以稳定多糖的螺旋构象。

Morris等[17]利用原子力显微镜得到的酸诱导的纤维结构和钙诱导的果胶凝胶结构的试验结果与本试验结果相似。研究发现果胶中的半乳糖醛酸基团与钙交联，起到粘性补丁的作用。本试验的SHP 富含半乳糖醛酸，受pH 和K+影响显著，通过影响分子间氢键互相缠结或链间缔合形成紧密的螺旋体纤维状结构或通过K+与多糖中的半乳糖醛酸基团螯合，形成具有分支的网状交联。

流变学研究结果表明，SHP 溶液属于假塑性流体，其黏度随质量浓度的增加呈现上升趋势。KCl 的加入降低了SHP 稠度系数及流动指数，增加了其表观黏度和应力值，溶液体系呈现弱凝胶状态，该结果验证了原子力显微镜的观测结果。