酪蛋白凝胶颗粒对水包油型乳液稳定性及体外消化的影响

陈 冲 张 宁 任怡镁 王鹏杰，3*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 北京工商大学 北京食品风味化学重点实验室 北京100048 3 中国农业大学营养与健康系 北京100094）

水包油乳液是由水相与油相组成的分散体系，其中油相以液滴的形式分散于水相中。水包油乳状液是食品的重要组成成分[1]，如牛奶、蛋黄酱和冰激凌等[2]。此外，水包油乳液也被用来包埋功能性物质，如色素、香精、抗菌剂、营养素、益生菌等[3-6]，增加这些物质的稳定性以及促进它们的吸收。然而，水包油乳液是热力学不稳定体系，油-水界面存在很高的界面自由能。有研究表明，乳化剂能够降低界面张力，是水包油乳液界面层的重要组成部分，影响界面层的结构（包括界面厚度、界面强度、电荷等），并对乳液的稳定性和消化性能（主要是界面反应）有很大影响[7-8]。

根据乳化剂分子大小，可将乳化剂分为3类：小分子乳化剂、生物大分子乳化剂、颗粒乳化剂。小分子乳化剂具有很高的乳化性能，能够迅速吸附到油水界面并且降低界面张力[9]。生物大分子乳化剂如蛋白类乳化剂吸附到油水界面后，发生结构的重排，从而稳定乳液[10]。然而，小分子乳化剂和大分子乳化剂界面吸附能低，易从界面脱离，导致乳液稳定性低。颗粒乳化剂由于界面吸附能高（能够不可逆吸附到油水界面）[11]以及能提供更大的空间位阻（10 nm 以上）[12]，因此能更好地稳定乳液。

目前，大部分颗粒类乳化剂均为无机颗粒如二氧化硅、二氧化钛、氧化铝等[13-15]，食品级颗粒类乳化剂较少，如几丁质、高温热变性的大豆蛋白和乳清蛋白[16-18]。不同种类的颗粒乳化剂对乳液体外消化影响不尽相同。研究表明，相比于常规商业乳化剂（如酪蛋白酸钠、乳清蛋白等），二氧化硅、几丁质等颗粒稳定的乳液脂肪消化能够被抑制[13，16]，而用乳清蛋白凝胶颗粒稳定的乳液的脂肪消化则无显著性变化[18]。

本文用京尼平交联自组装的酪蛋白酸钠制备的可食性酪蛋白凝胶颗粒，具有良好的乳化性能[19]。然而，其消化特性尚不明确。本试验探究用酪蛋白凝胶颗粒稳定的水包油乳液的体外消化性能，并与小分子乳化剂和生物大分子乳化剂作比较，探明乳化剂种类对水包油乳液稳定性及体外消化的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

酪蛋白酸钠、吐温20、胃蛋白酶、胰脂肪酶，美国sigma 公司；中链甘油三酯（MCT），北京科奥科技；京尼平，成都锦泰和医药化学有限公司；猪胆盐，北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、二水氯化钙、氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Titrino907 全自动电位滴定仪，瑞士万通有限公司；Mastersizer 3000 激光粒度仪，Zetasizer ZEN3600，英国Malvern 公司；Scientz-IID 超声细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；Turbiscan Tower，法国Formulaction 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酪蛋白凝胶颗粒的制备 酪蛋白凝胶颗粒的制备参照文献[19]的方法并作一定修改，将酪蛋白酸钠分散在水中，55 ℃下磁力搅拌3 h 至完全水合，形成10 g/L 的酪蛋白酸钠溶液。添加0.4 g/L的叠氮化钠抑制微生物生长并将酪蛋白酸钠溶液pH 调至7.1。将京尼平溶解在微量无水乙醇中，与酪蛋白酸钠溶液混合，使溶液中酪蛋白酸钠与京尼平的质量比为20∶1。将反应体系置于50 ℃恒温水浴中，恒温反应24 h，调节pH 使体系的pH 维持在（7.1±0.2）。反应结束后，将体系pH 调至6.8，备用。

1.3.2 水包油乳液的制备 分别取10 mL 10 g/L的酪蛋白凝胶颗粒溶液、酪蛋白酸钠溶液、吐温20 溶液与等体积的MCT 在50 mL 离心管中混合，涡旋振荡1 min 后超声，超声条件为：超声1 min（开3 s，停9 s），超声功率为190 W，变幅杆为6Φ。

1.3.3 水包油乳液稳定性分析 采用Turbiscan稳定性分析仪测定水包油乳液稳定性。测定方法根据Santos等[20]的方法并稍加修改。乳液制备1 h后，将乳液混匀并倒入玻璃测量瓶中，近红外光源（λair=880 nm）从测量瓶底到瓶顶垂直扫描，2 个同步光学探测器分别探测透过（180°）样品的透射光和被样品反射（45°）的背散射光。背散射光值与乳液液滴粒径和浓度有关，乳液液滴粒径变大，浓度下降，背散射光值下降；反之亦然。因此，通过比较测量样品的背散射光值随时间的变化，观察到乳液在测定过程中是否发生乳液液滴上浮、絮凝或者聚并的现象。

测定程序如下：25 ℃扫描24 h，扫描频率为10 min/次。

选取样品中部区域的光强值，采用仪器自带的软件计算水包油乳液的不稳定性指数（Turbiscan Stability Index，TSI），计算公式如下：

式中，xi——单次测量的背散射光强值；xBS——xi的平均值；n——扫描总次数。

1.3.4 水包油乳液粒径、电位分析 采用马尔文Mastersizer 3000 智能型激光粒度分析仪测定水包油粒径，所有样品测量3 次，取平均值。Zeta 电位采用Zetasizer ZEN3600 测定，所有样品在测量之前用超纯水稀释200 倍，每个样品测量至少3次，取平均值。

1.3.5 体外消化体系的构建 本试验中消化过程具体步骤参考Chang等[21]的方法并作了一定的修改，具体步骤如下：

取水包油乳液1 mL，用5 mmol/L 的磷酸缓冲液（pH 7.0）（后文所有提到的缓冲液均为该缓冲液）稀释到25 mL，预热到37 ℃，与等体积的已经预热到37 ℃的含有2 mg/mL NaCl 和3.2 mg/mL胃蛋白酶的模拟胃液混合，调pH 至2.0，37 ℃搅拌2 h，模拟胃部消化。

取25 mL 经过胃消化后的乳液，调pH 至7.0，然后加入1.5 mL 模拟肠液（37.47 mg/mL Ca-Cl2·2H2O，219.15 mg/mL NaCl）、3.5 mL 胆盐溶液（54 mg/mL），调pH 至7.0，加入2.15 mL脂肪酶溶液（24 mg/mL），保持消化体系温度为37 ℃，pH 为7.0，持续2 h，模拟肠消化。

1.3.6 水包油乳液粒径分析 初始的水包油乳液以及经过模拟胃、肠消化后的乳液的粒径采用马尔文Mastersizer 3000 智能型激光粒度分析仪测定。所有样品测量3 次，取平均值。

1.3.7 水包油乳液Zeta 电位分析 水包油乳液Zeta 电位采用Zetasizer ZEN3600 测定，所有样品在测量之前用相应的无酶消化液（如胃相中的乳液采用不含胃蛋白酶的模拟胃液稀释）稀释相应倍数，使体系最终稀释倍数与初始乳液稀释倍数相同，每个样品测量至少3 次，取平均值。

1.3.8 脂肪酸释放的测定 油滴经过脂肪酶的作用后水解为甘油单脂和游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA），采用Titrino907 全自动电位滴定仪的pH-stat 模式维持体系pH 值并记录所消耗的NaOH，计算游离脂肪酸的含量。假设一分子甘油三酯完全水解为一分子甘油单脂和两分子游离脂肪酸，那么释放的游离脂肪酸（FFA）的百分含量可以采用如下公式计算[21]：

式中，VNaOH——反应中中和游离脂肪酸的NaOH 的体积，mL；mNaOH——NaOH 溶液的浓度，0.1 mol/L；Mlipid——MCT 的分子质量，372.54 g/mol；wlipid——MCT 在消化前的总质量，0.235 g。1.3.9 统计分析方法 每个试验重复3 次，采用平均值±标准差来表示结果，采用SPSS 20 进行数据分析，采用Origin 8.0 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 用酪蛋白凝胶颗粒稳定的水包油乳液稳定性

图1 用不同种类乳化剂稳定的乳液的稳定性Fig.1 Stability of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

2.1.1 乳化剂种类对水包油乳液稳定性的影响乳化剂种类对水包油乳液稳定性的影响如图1所示。TSI 与乳液的稳定性成反比。结果表明，随着时间的延长，乳液的不稳定性增加，这是因为连续相与分散相之间的密度差致使乳液液滴上浮，随着时间的延长上浮现象越严重，不稳定性增加。样品中部区域光强值的变化主要反映乳液的聚集或者聚并情况[22]，而对于3种不同的乳化剂来说，酪蛋白凝胶颗粒稳定的水包油乳液TSI 最低，表明酪蛋白凝胶颗粒稳定乳液的能力显著高于吐温20和酪蛋白酸钠且能有效抑制乳液的聚集。

2.1.2 乳化剂种类对水包油乳液粒径的影响 图2是3种乳化剂稳定的乳液的粒径大小。结果显示，在相同乳化条件下，不同乳化剂稳定的乳液粒径大小排列顺序为酪蛋白凝胶颗粒>酪蛋白酸钠>吐温20，这可能与乳化剂的乳化性能相关。在乳化过程中，小分子乳化剂能够迅速吸附到油水界面形成乳液，乳化能力强，因而导致粒径小；蛋白类乳化剂吸附到油水界面的速率相对较慢[23]。而基于自组装酪蛋白结构的酪蛋白凝胶颗粒乳化性能相比于酪蛋白酸钠更低，这是因为酪蛋白酸钠在油水界面会分解并发生亲水疏水基团的重排，而酪蛋白凝胶颗粒则保持完整的结构吸附在油水界面。此外，由于在油水界面保持完整的结构[19]，酪蛋白凝胶颗粒也对水包油乳液的粒径产生了一定影响[19]。

2.1.3 乳化剂种类对水包油乳液Zeta 电位的影响 图3是3种乳化剂稳定的乳液的Zeta 电位大小，结果显示，酪蛋白酸钠和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液具有较高的负电荷且大小相近，这是因为酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒带有相近的负电位，吸附到油水界面后形成界面层，由于酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒自身所带电荷使乳液液滴具有较高的负电荷。吐温20是非离子表面活性剂，因此预料由其包被的乳液液滴将不带电荷。然而本试验中该乳化剂稳定的乳液液滴带少量负电，这可能是由于表面活性剂或油中存在游离脂肪酸杂质，或者油滴表面选择性吸附OH-（而不是H+）引起的[21]。

吐温20 稳定的乳液虽然粒径小，但是由于带电量小，界面厚度小（小于1 nm），从而导致静电排斥作用和空间位阻小，因此随着时间的迁移乳液逐渐聚集，稳定性下降。酪蛋白酸钠稳定的乳液虽然带电量高，界面厚度相对较高（1～10 nm）[12]，但是由于连续相中酪蛋白酸钠浓度较高，引起排斥絮凝现象[24]，即当相互靠近的乳液液滴距离小于酪蛋白分子大小时，相邻液滴间的渗透压低于连续相中的渗透压，因此对相邻的液滴产生一个作用力使乳液液滴聚集，乳液不稳定。酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液静电斥力较高且不可逆吸附在油水界面，形成厚而致密的保护层防止絮凝，从而提高乳液的稳定性。

图2 不同种类乳化剂稳定的乳液粒径Fig.2 Droplets size of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

图3 不同种类乳化剂稳定的乳液Zeta 电位Fig.3 Zeta potential of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

2.2 酪蛋白凝胶颗粒稳定的水包油乳液体外消化特性研究与比较

2.2.1 不同种类乳化剂稳定的水包油乳液体外消化过程中的粒径变化 图4是3种乳化剂稳定的水包油乳液经过模拟体外消化过程中乳液粒径的变化。3种乳化剂稳定的乳液粒径随着消化的进行而增加，且粒径分布范围变大。经过胃消化后，3种乳液的粒径都显著增加，但是吐温20 稳定的乳液粒径增加幅度相对较小，为初始粒径的1.57倍，而酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液粒径分别变为初始粒径的2.98 倍和2.86 倍。吐温20稳定的乳液粒径增加可能是因为在胃pH 以及较高盐离子浓度的环境下，水包油乳液液滴表面负电被中和而导致乳液液滴絮凝。酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液粒径显著增加可能是因为模拟胃液中的胃蛋白酶降解了酪蛋白，从而使得界面上的酪蛋白脱落，乳液液滴发生絮凝、聚并导致乳液液滴粒径变大。经过小肠消化后，3种乳液粒径均显著增加。这是因为模拟肠液中的胆盐能够取代存在于油水界面的吐温20 以及被降解的酪蛋白分子，脂肪酶随后降解胆盐覆盖区域的甘油三酯。甘油三酯水解形成的产物有一定的乳化性能，但是由于它们较低的表面黏度和弹性，使得乳液更趋向于聚并从而导致乳液粒径变大[25]。粒径的变化表明在油水界面的酪蛋白凝胶颗粒可能在胃消化的过程中被胃蛋白酶降解，从而在进入小肠消化阶段不能保持完整的颗粒结构，最终无法像二氧化硅纳米颗粒、几丁质颗粒一样抑制脂肪的消化[13，16]。

图4 乳液在体外消化过程中粒径分布图Fig.4 Size distribution of oil-in-water emulsions during in vitro digestion

2.2.2 不同种类乳化剂稳定的水包油乳液体外消化过程中的Zeta 电位变化 通过测定乳液的Zeta电位，考察模拟消化过程中不同种类乳化剂稳定的水包油乳液界面吸附特性。不同种类乳化剂稳定的水包油乳液随着消化的进行Zeta 电位变化情况如图5所示。经过模拟胃消化后，酪蛋白和酪蛋白颗粒稳定的乳液Zeta 电位发生显著性变化，由带负电变为正电。这主要是因为模拟胃液的pH是2，在酪蛋白的等电点以下，因此Zeta 电位为正。而吐温20 稳定的乳液负电荷被中和，因此带正电。此外，酪蛋白稳定的乳液的Zeta 电位值接近零而不是在明显低于酪蛋白酸盐等电点（约为pH 4.8）的pH 值下所预期的带大量正电荷。这可能是由于吸附到油滴表面的蛋白质分子的部分或完全水解从而改变界面组成和性质。这样的Zeta值不足以稳定乳液，因此可能造成乳液的絮凝和聚并从而导致乳液粒径变大。所有乳液在小肠消化后显示出带有相对高的负电荷而且绝对值相差不大。这表明经过小肠消化后，原有的由乳化剂（吐温20、酪蛋白以及酪蛋白凝胶颗粒）形成的界面层已经完全被取代。这些电荷可能源于消化物中存在各种类型的阴离子颗粒物质（例如未消化的蛋白质聚集体，未消化的脂滴，胶束或囊泡），它们表面具有带负电荷的物质（例如肽或游离脂肪酸）[21]。

图5 乳液在体外消化过程中Zeta 电位的变化Fig.5 Changes in Zeta potential of oil-in-water emulsions during in vitro digestion

2.2.3 不同种类乳化剂稳定的水包油乳液体外消化过程中的脂肪酸释放变化 使用pH-stat 方法测定乳化剂类型对脂质消化的影响。如图6所示，3种乳化剂稳定的乳液总的脂肪酸释放量没有显著性差异，表明本试验中乳化剂种类没有影响最终的消化结果，但是消化过程有差异。吐温20 稳定的乳液在初始阶段游离脂肪酸的释放快速增加，在之后更长时间内逐渐增加，直到达到顶点。而酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液则先缓慢消化，然后快速上升，最后到达顶点。这些现象可能与小肠消化开始时酪蛋白和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液粒径远大于吐温20 稳定的乳液有关，因为吐温20 稳定的乳液粒径小，比表面积大，与胆盐和脂肪酶反应面积就大，所以油滴更易被脂肪酶降解。而且大分子乳化剂形成的界面膜对胆盐取代的抵抗能力也比小分子乳化剂强。酪蛋白稳定的乳液消化曲线和酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液几乎相同，证实了在模拟胃的消化过程中，酪蛋白凝胶颗粒已经被蛋白酶降解，不再保持完整的颗粒结构，因此并不会抑制脂肪消化。

图6 乳液在体外消化过程中游离脂肪酸的释放Fig.6 Free fatty acid release of the emulsions during in vitro digestion

3 结论

本文研究了自组装的酪蛋白酸钠经京尼平交联之后形成的酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液的稳定性和体外消化性能，并与吐温20 和酪蛋白酸钠进行比较。结果显示，酪蛋白凝胶颗粒稳定的乳液稳定性最好，这与酪蛋白凝胶颗粒能以完整的颗粒结构存在于油水界面并形成强大的空间位阻和静电效应有关。不同种类的乳化剂对水包油乳液的初始消化有影响，酪蛋白凝胶颗粒和酪蛋白酸钠初始消化速率低，这与乳液的粒径和乳化剂形成的界面层结构相关，但是并不影响消化终点。此外，酪蛋白凝胶颗粒与酪蛋白酸钠的消化曲线无显著性差异，可能是因为酪蛋白凝胶颗粒在胃消化阶段被胃蛋白酶降解从而导致颗粒结构被破坏。由此表明，酪蛋白凝胶颗粒能够更好地稳定水包油乳液且不影响其消化。