高核苷酸酵母水解物调控HepG2细胞氧化损伤作用

潘 聪 张大力* 段盛林 苑 鹏 夏 凯 李占东于伟厚 刘美宏 于寒松 赵可心

（1 吉林农业大学食品科学与工程学院 长春130118 2 中国食品发酵工业研究院有限公司 北京100015 3 吉林工程技术师范学院食品工程学院 长春130052 4 大连双迪科技股份有限公司 辽宁大连116635）

酵母水解物（Yeast hydrolyzate，YH）也称复合酵母，是利用内源酶（细胞内自溶酶）及外源酶水解释放核酸和小肽等功效成分而获得的纯培养酵母自溶物。高核苷酸酵母水解物（High nucleotide yeast hydrolyzate，HNYH）富含大量核酸、核苷酸（AMP，CMP，GMP，UMP，IMP）、小肽、消化酶、游离氨基酸、B 族维生素及酵母细胞壁。核苷酸具有多种生物学活性[1-2]，在能量代谢及蛋白质生物合成过程中起着重要的作用[3]。据报道，酵母核苷酸具有抗氧化，增强机体免疫力及维持机体胃肠道功能等作用。核苷酸作为核酸的组成单位，几乎参与体内所有代谢过程，是体内许多酶和辅酶的重要组成成分，在细胞物质与能量代谢以及功能调节中起重要作用[4]。近年来的研究表明，酵母核苷酸具有提高免疫力，促生长，抗氧化，促进机体损伤修复，降低细胞凋亡以及抗炎等功能[5-8]。Ames等[9]认为核酸及相关物质均可作为内源性自由基清除剂和抗氧化剂，具有与VC类似的作用。

氧化应激是指机体氧化系统和抗氧化系统失衡的一种状态。氧化应激损伤会产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和自由基，引发脂质过氧化反应生成丙二醛（Malonicdialdehyde，MDA）。氧化应激会导致细胞膜通透性增强，促进胞内乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）向胞外释放。此外，氧化应激会引发自由基链式反应，降低超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，最终导致细胞死亡[10-12]。

目前，关于高核苷酸酵母水解物的体外抗氧化作用及其机制尚无深入研究，相关核苷酸抗氧化能力多基于体内动物实验。本研究分析了高核苷酸酵母水解物在体外条件下清除活性氧的能力及其对氧化应激损伤细胞的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高核苷酸酵母水解物（经测定高核苷酸酵母水解物中蛋白质含量61.95%，氯化钠0.2%，总核苷酸含量13.56%。其中0.049% AMP，2.17%CMP，3.39% GMP，3.54% UMP，4.42% IMP），大连珍奥生物技术有限公司提供；AMP，CMP，GMP，UMP，IMP 5种核苷酸标品，北京华威思科科技有限公司；肝癌细胞株（HepG2），中国食品发酵工业研究院保存；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培养基、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、平衡盐缓冲液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）、DMEM无糖培养基、小牛血清，美国Gibco 公司；油酸（Oleic acid，OA）、棕榈酸（Palmitic acid，PA）、DCFH-DA、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑兰（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenylterazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶，美国Sigma 化学公司；无FFA 牛血清蛋白（FFA-free bovine serum albumin，BSA），日本WAKO 公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、氧自由基（ROS）试剂盒，南京建成生物工程研究所；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、山羊抗鼠IgG/HRP 二抗、山羊抗兔IgG/HRP 二抗，碧云天生物有限公司；鼠抗β-actin 单克隆抗体、兔抗Nrf2 单克隆抗体、兔抗PARP 单克隆抗体，美国Cell Signaling Technology公司；TransZol Up RNA 提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；所有有机溶剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，岛津（上海）实验器材有限公司；低温高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；倒置生物显微镜，日本OLympus 公司；生物安全柜，中国济南鑫贝西生物技术有限公司；37 ℃CO2培养箱MCO-20AIC，松下健康医疗器械（上海）有限公司；酶标仪Spectra Max i3，美国MD 公司；分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-250DE 超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；pH 计，上海雷磁仪器厂；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DK-8D三温三控水槽，上海博迅实业有限公司；电泳仪、转膜仪，伯乐有限公司。

1.3 试验方法

称取高核苷酸酵母水解物溶于超纯水中，离心（4 000 r/min，10 min）取上清待用。

1.3.1 DPPH 自由基清除作用检测 参照文献[13]的方法，准确称取0.0079 g DPPH 用无水乙醇溶解，定容至100 mL，配制成浓度为2×10-4mol/L的DPPH 溶液。精确取1 mL 不同浓度的待测液于5 mL 离心管中，加入1 mL DPPH 溶液和0.5 mL 75%的乙醇，使体系总体积为2.5 mL。避光反应30 min，3 000 r/min 离心取上清。采用酶标仪在波长517 nm 处测吸光值，以吸光值的下降表示其对自由基的消除能力。DPPH 自由基清除率根据式（1）计算：

式中，A0——加DPPH（1 mL DPPH+1 mL 水+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度；A1——样品与DPPH反应后的吸光度（1 mL DPPH+1 mL 待测液+0.5 mL 75%乙醇）；A2——样品的空白对照（1 mL 75%乙醇+1 mL 待测液+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度；A空白——DPPH 空白对照（1 mL 75%乙醇+1 mL 水+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度。

1.3.2 羟自由基清除检测 参照文献[14]的方法，取若干10 mL 离心管，依次加入0.6 mL 的FeSO4（8.0 mmol/L），0.5 mL 的H2O2（0.02 mmol/L），2 mL的水杨酸（3 mmol/L）及2 mL 不同梯度稀释的样品。37 ℃保温30 min 后，加入0.9 mL 的HCl（1 mol/L）终止反应，反应体系终体积为6.0 mL，转速3 000 r/min，离心10 min，取上清测定波长510 nm处的吸光度值，以多酚提取物抑制羟自由基引发的水杨酸羟基化作用的程度表示其羟自由基的清除能力。样品清除率根据式（2）计算：

式中，A0——空白组吸光度；A1——样品的吸光度；A2——样品空白对照的吸光度。

1.3.3 总还原力的检测 参照文献[15]的方法，配制芦丁标准品溶液。精确称取芦丁标准品（纯度≥98%）30.0 mg，加入10 mL 无水甲醇溶解，转移到100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准品溶液，质量浓度为300 μg/mL。分别加入pH 6.6 的PBS 缓冲液1.0 mL、1%铁氰化钾溶液1.0 mL、不同质量浓度待测液1.0 mL 于试管中，摇匀后置于50 ℃水浴锅中加热20 min，待冷却后加入1%三氯乙酸2.5 mL 并摇匀，离心（3 000 r/min，10 min），吸取2.0 mL 于另一只试管中，加入蒸馏水5.0 mL 和0.1%三氯化铁1.0 mL，混匀后静置10 min，于波长700 nm 处测定反应体系的OD 值，每组试验重复3 次后求得平均值，绘制总还原能力变化曲线。

1.4 HepG2 抗氧化模型

1.4.1 HepG2 的培养 参考文献[16]的方法，人肝癌细胞株HepG2 培养于含10%新生牛血清，青霉素100 U/mL 和链霉素100 μg/mL 的DMEM 培养基中（下文简称DMEM10），在37 ℃，5% CO2培养条件下常规培养。选取对数生长期细胞以3.5×106个/mL 浓度接种于96 孔板中，待细胞贴壁并长满时，用PBS 润洗细胞一次，加入不同的处理液，试验分组如下：对照组（DMEM10）、模型组（FFA 200 μg/mL）以及不同质量浓度高核苷酸酵母水解物的试验组（试验组1 质量浓度300 μg/mL、试验组2质量浓度500 μg/mL、试验组3 质量浓度1 000 μg/mL）。

1.4.2 MTT 法测定HepG2 细胞存活率 取96 孔培养板，每孔加100 μL 细胞悬液，HepG2 细胞浓度为1×105个/mL，37 ℃培养24 h 后弃去培养液，用PBS 清洗一次，试验组加入不同质量浓度的高核苷酸酵母水解物干预处理24 h 后除去培养液。加入0.5 mg/mL MTT-DMEM，于37 ℃避光孵育4 h，加入100 μL DMSO，振荡以便完全溶解MTT 紫色结晶产物。用酶标仪在波长490 nm 处测定吸光度值。以对照组细胞的细胞存活率为100%计算其余组别细胞存活率。

1.5 氧化指标检测

1.5.1 ROS 的测定 取对数生长期HepG2 细胞，将对照组、模型组、试验组分别进行相应处理。弃掉细胞培养液，每孔加入2 mL 的荧光探针DCFH-DA（10 μmol/L），于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。无血清细胞培养液洗涤细胞3 次后，收集细胞，用酶标仪测定吸光度值，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，结果以模型组ROS 含量的百分比表示。

1.5.2 氧化损伤标志物测定 按1.4.1 节的不同分组处理细胞，试验结束离心收集细胞，用预冷的PBS 洗涤3 次，加入细胞裂解液裂解3～5 s，离心（2 500 r/min，10 min）并收集细胞上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞上清液蛋白质含量，MDA 含量按试剂盒方法测定，结果以mmol/mg 表示。

1.5.3 SOD 和GSH-Px 活力测定 按1.4.1 节的不同分组处理细胞，试验结束离心收集细胞，用预冷的PBS 洗涤3 次，加入细胞裂解液，冰浴条件下裂解3～5 s，离心（2 500 r/min，10 min）并收集细胞上清液。BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定上清液蛋白浓度，SOD 和GSH-Px 酶活按检测试剂盒方法测定，酶活力以U/mg 表示。

1.6 高核苷酸酵母水解物对FFA 刺激HepG2细胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表达水平的影响

RT-PCR 检测keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1的mRNA 表达水平。收集各组肝癌细胞，按照全式金试剂盒说明书提取细胞总RNA，用RNA/DNA 超微量测定仪对RNA 进行定量分析，测定RNA 纯度及浓度。PCR 反应条件为：45 ℃，5 min；94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，1 min；循环40 次。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，使用Bio-Rad 公司图像分析仪成像并进行半定量分析，引物序列如表1所示。

1.7 免疫印迹检测Nrf2 蛋白的表达水平

采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒于冰上分离各组样品细胞中的核蛋白和浆蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。采用免疫印迹试验检测Nrf2 蛋白的表达水平，保持凝胶电泳每孔蛋白质上样量达30 μg，利用10% SDS-PAGE分离样品，转膜，加入5%脱脂奶粉封闭2 h。将膜置于按体积比1∶1 000 配制的一抗稀释液中4 ℃过夜，加入TBST 洗膜3 次，将膜浸入按体积比1∶1 000 配制的二抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1 h，加入TBST 洗膜3 次。加入ECL 显色液，曝光显色，利用Image J 软件分析灰度值。

表1 试验用各目标基因特异性引物序列Tab1e 1 Sequences of primers for target genes of amplified fragment

1.8 统计学处理

2 结果与分析

2.1 HNYH 体外抗氧化指标

DPPH是自由基清除活性试验中的一个重要的化学试剂，OH·被认为是最能体现活细胞中抗氧化活性的指标，它可以参与所有活细胞和生物大分子的代谢反应[17]。抗氧化剂能通过自身的还原作用，通过给出电子清除自由基，其还原能力越强表明其抗氧化能力越强。根据试验结果得出芦丁标准曲线为y=0.9596x-0.007，R2=0.9945，将总还原力OD 值换算成有效成分芦丁质量浓度，结果如表2所示，随着高核苷酸酵母水解物质量浓度增大，DPPH 清除率、羟自由基清除率、总还原能力逐渐增强，说明高核苷酸酵母水解物的抗氧化能力逐渐增强。

表2 不同质量浓度高核苷酸酵母水解物的DPPH，OH- 清除率和总还原力Table 2 Different mass concentration of high-dose yeast hydrolysates DPPH，OH- clearance and total reducing power

2.2 HNYH 对HepG2 细胞活力的影响

由表3可知，各质量浓度组的细胞存活率都在95%以上，说明高核苷酸酵母水解物在100～1 000 μg/mL 范围内对HepG2 细胞均无明显的毒性作用。

表3 不同质量浓度高核苷酸酵母水解物对HepG2细胞活力的影响Table 3 Effects of different mass concentration of high-dose yeast hydrolysates on the viability of HepG2 cells

2.3 HNYH 对FFA 诱导的HepG2 细胞内氧化指标的影响

2.3.1 ROS 的含量 细胞内过量ROS 的产生会使细胞处于氧化应激状态，进而对细胞造成氧化损伤。因此，细胞内ROS 含量可以直接反应映细胞氧化损伤的程度[18]。采用荧光探针DCFH-DA法，测定各组HepG2 细胞中ROS 含量，结果如图1所示。试验组和对照组ROS 含量均显著低于模型组（P<0.05）。FFA 能通过诱发大量ROS 的生成对HepG2 细胞造成损伤，而高核苷酸酵母水解物则通过降低细胞中ROS 的含量对HepG2 细胞起到保护作用。

2.3.2 MDA 的含量 MDA是细胞内脂质的氧化损伤标志物，其含量间接反映机体内脂质过氧化水平。MDA可由细胞膜上的脂质与ROS 发生过氧化反应生成，能破坏甚至摧毁细胞膜[19]。MDA 能和硫代巴比妥酸反应生成红色物质，利用这一性质可测定HepG2 细胞内的MDA 含量。由图2可知，模型组的MDA 含量显著高于对照组（P<0.05），这与FFA 能诱发细胞产生大量ROS 密切相关；而试验组随着高核苷酸酵母水解物质量浓度的增加，FFA 诱导HepG2 细胞内的MDA 含量逐渐减少，这一结果与2.3.1 节ROS 含量测定的结果相符，说明高核苷酸酵母水解物能够缓解FFA 对HepG2 细胞内脂质的氧化损伤。

图1 HNYH 对FAA 诱导的HepG2 细胞内ROS 含量的影响Fig.1 Effects of HNYH on ROS production in FAA-induced HepG2 cells

图2 HNYH 对FAA 诱导的HepG2 细胞内MDA 含量的影响Fig.2 Effects of HNYH on the content of MDA in FAA-induced HepG2 cells

2.4 高核苷酸酵母水解物对FFA 诱导的HepG2细胞抗氧化指标的影响

2.4.1 SOD 活力 SOD是一种金属酶，是机体内抵抗ROS 损伤的第一道防御关卡，可以使有毒的超氧化自由基降解为氧和过氧化物[20]。由图3可知，除试验组1 外其余组SOD 的酶活力均显著大于模型组（P<0.05）。说明高核苷酸酵母水解物能通过提高胞内SOD 的酶活力保护HepG2 细胞抵抗FFA 诱导的损伤作用，并且与高核苷酸酵母水解物的质量浓度呈正相关，高核苷酸酵母水解物的这一功能可能与细胞内的一种核转录因子Nrf2相关[21]。

2.4.2 GSH-PX 酶活力 GSH-Px是机体存在的一种清除自由基和抑制自由基反应的酶系统，其活力水平也是评价机体抗氧化能力的重要指标。GSH-Px 在体内能通过GSH 调控ROS 生成并清除有机过氧化物[22]。GSH是一种内源性巯基化合物，对维持细胞氧化还原平衡和氨基酸平衡，调控细胞基因及胞内信号转导起重要作用，并且GSH还与多种蛋白质的结构、功能和稳定性有关[23]。由图4～5可知，试验组2 和3 的GSH-Px 酶活力显著高于模型组（P<0.05），并呈质量浓度依赖性趋势，说明高核苷酸酵母水解物能通过提高胞内GSH-Px 的酶活力和细胞上清GSH-Px 的酶活力保护HepG2 细胞抵抗FFA 诱导的损伤作用，并且与高核苷酸酵母水解物的质量浓度呈正相关，与SOD 酶活力的变化趋势一致。

图3 HNYH 对FFA 诱导HepG2 细胞内SOD 酶活力的影响Fig.3 Effects of HNYH on enzyme activities of SOD in FFA-induced HepG2 cells

图4 HNYH 对FFA 诱导HepG2 细胞内GSH-Px 酶活力的影响Fig.4 Effects of HNYH on enzyme activities of GSH-Px in FFA-induced HepG2 cells

2.5 HNYN 对FFA 诱导的HepG2 细胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表达的影响

图5 HNYH 对FFA 诱导HepG2 细胞上清GSH-Px 酶活力的影响Fig.5 Effects of HNYH on enzyme activities of GSH-Px in FFA-induced HepG2 cells supernatant

图6 HNYH 对FFA 刺激的HepG2 细胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表达水平的影响Fig.6 Effects of mRNA expression levels of keap1，Nrf2，HO-1 and NQO-1 after the intervention of HNYH on HepG2 cells stimulated by FFA

Keap1-Nrf2/ARE 信号通路是调节机体氧化系统和抗氧化系统平衡，调控体内抗氧化防御机制的重要途径[24]。该信号通路可以通过编码HO-1内源性保护基因实现对HepG2 细胞氧化损伤的保护作用[25-26]。Nrf2是调节ARE 驱动的II 期基因表达的主要转录因子，HO-1，NQO-1 和keap1等抗氧化基因的表达均有Nrf2 参与。正常生理情况下，Nrf2 位于胞浆中并与Keap1 结合形成复合体。当机体受到氧化应激损伤时，Nrf2 与Keap1 解离，Nrf2 进入细胞核与ARE 结合，激活抗氧化酶（HO-1，SOD，GSH-Px）以及Ⅱ相解毒酶的转录活性，从而发挥抗氧化损伤作用，恢复细胞的内稳态[27-28]。如图6所示，与正常组相比，模型组的Nrf2，HO-1 和NQO-1 的mRNA 表达水平均显著降低，试验组质量浓度依赖性地增高Nrf2，HO-1和NQO-1 的mRNA 表达水平，而keap1 的mRNA表达水平随HNYH 质量浓度增大逐渐降低。

2.6 HNYN 干预对Nrf2 活化与转位的影响

Nrf2是细胞降低活性氧，抵御外来有害刺激的重要转录因子。正常生理情况下，Nrf2 与胞浆中的抑制因子Keap1 结合，处于无活性状态，并经泛素化快速降解。在诱导Nrf2 激活后，Nrf2 与Keap1分离，转入细胞核中，识别并结合抗氧化反应元件（ARE），启动下游基因表达，增强细胞抗损伤能力，从而有效抵抗有害物质的攻击。Nrf2 调控的下游基因主要为Ⅱ相解毒酶基因、抗氧化基因和应激基因等，其编码的蛋白质与自由基和外源性化学物质等的代谢、清除以及恢复并维持内环境稳态密切相关[29-30]。由图7可知，高核苷酸酵母水解物能够以质量浓度依赖性的方式增加HepG2 细胞核内的蛋白质含量，降低胞浆蛋白质含量，进一步阐明了高核苷酸酵母水解物对FFA 诱导的HepG2 氧化损伤的保护机制。

图7 HNYH 对FFA 诱导HepG2 细胞中Nrf2 活化与转位的影响Fig.7 Effects of HNYH on activation and translocation of Nrf2 in HepG2 cells induced by FFA

3 结论

结果表明，HNYN 具有较高的体外抗氧化活性，并能以质量浓度依赖性的方式清除DPPH 和羟自由基，提高总还原力。MTT 试验结果显示100～1 000 μg/L 的HNYN 对HepG2 细胞存活率无显著影响。建立游离脂肪酸诱导HepG2 氧化应激细胞模型，发现HNYN 通过降低细胞内ROS 的水平，改善抗氧化物酶SOD 和GSH-Px 的活性，缓解细胞内氧化损伤，并且与HNYN 质量浓度呈正相关。RT-PCR 试验结果显示，HNYN 能显著提高Nrf2、HO-1 和NQO-1 的mRNA 表达水平，并随着质量浓度增大降低keap1 的mRNA 表达水平。免疫印迹试验发现，高核苷酸酵母水解物能够显著增加HepG2 细胞核内Nrf2 的蛋白质含量，降低胞浆内Nrf2 蛋白质含量，表明HNYN 对FFA诱导HepG2 细胞氧化损伤的保护作用与增强细胞抗氧化酶活性、降低自由基水平相关。进一步表明HNYN可通过调节Keap1-Nrf2 信号通路，发挥其对FFA 诱导HepG2 细胞氧化损伤的保护作用。

本研究结果表明HNYN 具有显著的体外抗氧化活性，并且能够通过激活Nrf2 通路减轻FFA诱导的HepG2 氧化应激损伤，为HNYN 作为一种抗氧化食品原料成分提供了理论依据。然而，本试验只评价了高核苷酸酵母水解物的体外抗氧化活性，酵母核苷酸单一成分的功能性仍需要更深入的研究。