降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子的乳酸菌筛选及淬灭作用

崔天琦 吕欣然 孙梦桐 马国涵 白凤翎 杜 宏 励建荣

（渤海大学食品科学与工程学院 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心辽宁省高等学校生鲜食品产业技术研究院 辽宁锦州121013）

细菌性疾病是阻碍水产养殖产业发展的关键性问题之一，应用抗生素控制细菌性感染是许多国家防治水产养殖动物疾病的主要方法[1]，然而大量使用抗生素导致细菌耐药性，与抗生素使用剂量和频率之间形成恶性循环[2]。引起水产养殖经济鱼类细菌性感染的病原体多为水体生态环境中的革兰氏阴性菌，通常通过群体感应（Quorum sensing，QS）现象如形成生物膜、毒力因子和迁移能力发挥致病作用[3]。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种导致人-兽-水生动物共患病的革兰氏阴性条件致病菌，可引起鲤鱼、金钱鱼、黄鳝和大菱鲆等多种水生动物出现败血症[4-5]。应用群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitor，QSIs）和群体感应淬灭作用控制细菌性疾病是目前一种生态友好型策略[6]。

大多革兰氏阴性菌QS是由AHLs 信号分子介导的。阻断、干扰和破坏QS 的机制主要由2种[7]：一是利用干扰AHLs 信号分子的化合物，即QSIs阻断细胞间分子信息传递，例如红海藻（Delisea pulchra）合成的卤代呋喃酮[8]；二是利用群体感应淬灭酶降解或转化AHLs 信号分子，使其失去信息传递功能，称为群体感应淬灭作用（Quorum quenching，QQ）[9]。群体感应淬灭酶主要包括AHLs-内酯酶、AHLs-酰基转移酶和氧化还原酶3种类型[10-11]。研究表明海洋生态环境中放线菌（Actino bacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）的微生物类群可以产生对AHLs 具有淬灭作用的酶[12]。Romero等[13]证明海洋细菌 黄杆菌属（Tenacibaculum sp.）20J 的粗提物对鱼类病原性弧菌迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）AHLs 信号分子具有淬灭活性；Kiymaci等[14]从新生儿粪便中分离出潜在的益生菌菌株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）M7 中的乳酸，检测其对 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS 信号分子和某些毒力因子的抑制作用，结果显示乳酸对短链HSL的产生、群集泳动、蛋白酶、绿脓菌素和生物膜形成具有一定的抑制作用；Pattnaik等[15]利用真菌大豆茎溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum）SSP12 抑制了铜绿假单胞菌PAO1 群体感应调控的毒力因子及生物膜的形成。Torres等[16]从双壳贝类孵化场分离的450种菌株中筛选出具有QQ 活性的菌株——极地寡营养细菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42，其能降解多种AHLs，在体外共培养试验中抑制了4种病原性弧菌AHLs 的积累，并抑制弧菌种类中蛋白酶和几丁质酶的产生以及群集泳动性。

乳酸菌是一类具有拮抗作用和益生功能的生态友好型细菌，主要存在于传统发酵食品、动物肠道及土壤淤泥等自然环境中[17]。以乳酸链球菌素为代表的乳酸菌生物制剂具有安全高效、绿色无残留等特点，已广泛应用于乳制品、肉制品和水产品等的防腐保鲜[18]。乳酸菌是否具有淬灭革兰氏阴性菌群体感应的作用，以及其能否作为微生物源性QSIs 应用于水产养殖致病菌的防控，在国内外研究中鲜见报道。

本文从传统发酵食品以及海水鱼肠道中分离的乳酸菌中筛选对嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子具有降解作用的菌株，探究乳酸菌对革兰氏阴性菌群体感应的淬灭作用机制，对利用活性乳酸菌制剂防控水产养殖病原菌的感染具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株及培养条件 乳酸菌菌株：传统发酵食品和海水鱼肠道中筛选得到156 株乳酸菌菌株，其中，来源于辽宁锦州酵头、辽宁朝阳咸菜等传统发酵食品的乳酸菌菌株有124 株，来源于牙鲆、带鱼等鱼类肠道的乳酸菌32 株。

指示菌株：紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026 为紫色杆菌ATCC 31532 的mini-Tn5 突变体，自身不产生N-酰基-高丝氨酸内酯类信号分子（AHLs），仅当外源 AHLs 存在时，菌株可产生紫色菌素，可检测到C4-HSL，C8-HSL的信号分子。

目标菌株：嗜水气单胞菌LY-2，分离自腐败大菱鲆体表。

以上菌株均为本实验室保藏。

1.1.2 培养基和试剂 MRS 培养基、LB 培养基、DNA 酶培养基、酪蛋白培养基、血琼脂基本培养基、无菌脱纤维羊血，北京奥博星生物技术有限公司；乳酸菌生化鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司；卡那霉素、细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；C4-HSL、C6-HSL 信号分子标品，美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-2N 超级洁净工作台，北京市东联哈尔仪器制造有限公司；SPX-250 生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；IKA Vortex GENIUS 3 振荡器，德国IKA 公司；5804R 高速冷冻离心机、ABI stepone plus PCR 仪，德国Eppendorf 公司；DYY-8C 电泳仪，北京市六一仪器厂；Quantity One 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；MS105UD电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶标仪，美国BIO-RAD；GI54DS 立式高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Labconco Free Zone 2.5 台式真空冷冻干燥机，美国LABCONCO；气相色谱-质谱联用仪7890A-5975C，美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化及嗜水气单胞菌AHLs 粗提物的制备 乳酸菌接种于MRS 液体培养基中，以2.0%的接种量传代培养2 次后于37 ℃培养12 h。嗜水气单胞菌和紫色杆菌分别接种于LB 液体培养基中，传代培养2 次后于30 ℃培养12 h；取4 mL 2 代紫色杆菌以及200 μL 卡那霉素于200 mL LB培养基中，于30 ℃培养24 h，4 ℃冰箱保存备用。

将活化后的嗜水气单胞菌于4 ℃，10 000 r/min 条件下离心5 min 得上清液，用0.45 μm 滤膜过滤获得嗜水气单胞菌无细胞上清液（Cell free supernatants，CFS），4 ℃冰箱保存备用。取嗜水气单胞菌CFS 100 mL 置于250 mL 分液漏斗中，将含有0.01%冰醋酸的等量乙酸乙酯分5 次加入萃取，加入溶剂后沿同一方向缓慢震荡后静置，待分层明显时收集乳化层置于三角瓶中。将5 次萃取液合并，在45 ℃，120 r/min 条件下真空旋转蒸发至有机溶剂气味消失，将残留液转存至无菌1.5 mL 离心管中，用体积分数为70%的甲醇悬浮，置于-18 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌的初筛采用96 孔微量板法测定乳酸菌菌株对嗜水气单胞菌AHLs 的降解活性。取10.0 μL 嗜水气单胞菌AHLs 粗提物加入到乳酸菌2 代培养物中（调节pH 7.0），30 ℃条件下培养24 h。取24 h 培养物调节pH 至7.0，于4 ℃，10 000 r/min 条件下离心5 min 后取培养物上清液，备用。

将LB 琼脂加到96 微孔板的孔中并使其干燥，将培养物上清液在软琼脂表面上点样，顶层用100 μL 含有紫色杆菌（体积比5∶1）的LB 软琼脂覆盖，30 ℃条件下培养24 h。将相同量的嗜水气单胞菌AHLs 加入到无细胞MRS 液体培养基中，并按相同条件培养并点样在微孔板上，作为阴性对照。

1.3.3 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌的复筛采用琼脂平板扩散法对具有降解活性的初筛菌株复筛。取10.0 μL 嗜水气单胞菌AHLs 粗提物添加到2 代乳酸菌培养物中（调节pH 7.0），30 ℃条件下培养24 h。将培养物于4 ℃，10 000 r/min 条件下离心5 min，获得培养物上清液，备用。

取2.0 mL 紫色杆菌与25.0 mL LB 琼脂混匀，倒入底层铺有素琼脂的平板中，用牛津杯打孔，在孔内加入180 μL 培养物上清液，于30 ℃条件下旋转振荡培养24 h，测量孔周围出现的紫色晕圈直径。将相同量嗜水气单胞菌AHLs 加入到1.0 mL 无细胞MRS 液体培养基中，与按相同条件培养并加入到牛津杯孔内，作为阴性对照。乳酸菌对嗜水气单胞菌AHLs 降解率按式（1）计算：

式中，D（对照）——对照组紫色圈直径，mm；D（QSI）——乳酸菌处理组紫色圈直径，mm。

1.3.4 乳酸菌粗提物的制备 取乳酸菌CFS 100 mL 于250 mL 分液漏斗中，将等量乙酸乙酯分5次加入萃取，加入溶剂后沿同一方向缓慢振荡后静置，待分层明显时收集乳化层置于三角瓶中。将5 次萃取液合并，于45 ℃，120 r/min 条件下真空旋转蒸发至有机溶剂气味消失，残留液转存至无菌锥形瓶中，真空冷冻干燥制成粉末，置于-18 ℃冰箱备用。

1.3.5 AHLs 降解活性的测定

1.3.5.1 样品制备 采用体积分数为70%的甲醇将C4-HSL 和C6-HSL 信号分子标品配制成200 μg/L 的溶液，备用。

乳酸菌粗提物和嗜水气单胞菌上清液的共培养物按1.3.1 节步骤萃取AHLs 信号分子，经旋转蒸发的残留液转存至无菌1.5 mL 离心管中，用体积分数为70%的甲醇悬浮，置于-18 ℃冰箱保存。样品及溶剂均经0.45 μm 有机滤膜过滤处理。

1.3.5.2 乳酸菌降解AHLs 活性的分析 采用安捷伦Agilent 7890A/5975C 进行GC-MS 分析，气相色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS 石英毛细管柱（30 μm×250 μm×0.25μm）；载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样口温度为200 ℃；传输线温度为280 ℃。升温程序采用3 阶段升温，第1阶段：初温150 ℃，溶剂保留时间为3 min，以10℃/min 的升温速率升到220 ℃，运行时间7 min；第2 阶段：以5 ℃/min 的升温速率升到250 ℃，运行时间6 min；第3 阶段：以0.5 ℃/min 的升温速率升到252.5 ℃，运行时间5 min。进样量为1.0 μL，分流进样，分流比50：1，运行总时间18 min。质谱条件：电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃。扫描方式为全扫描模式m/z 15～800 和选择离子检测（SIM）模式m/z 143。

1.3.6 乳酸菌QQ 酶的鉴定 参照Romero等[13]的方法稍作修改。将嗜水气单胞菌AHLs 和乳酸菌培养物在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心5 min，将上清液用1.0 mol/L HCl 调节pH 至2.0，于30 ℃条件下孵育24 h，采用琼脂平板扩散法进行检测。

1.3.7 QQ 活性位置的确定 为确定乳酸菌菌株的QS AHLs 降解活性位置，参照Torres等[16]的方法稍作修改。采用具有AHLs 降解活性菌株24 h培养物的CFS 和粗细胞提取物（Crude cell extract，CCE）分析降解活性位置。将15.0 mL 乳酸菌的过夜培养物于4 ℃，10 000 r/min 条件下离心5 min，获得培养物上清液，经0.45 μm 过滤器过滤获得CES，于4 ℃冰箱保存备用。

将乳酸菌沉淀物用15.0 mL pH 6.5 的PBS洗涤，加5.0 mL 相同缓冲液重悬，在冷水浴中间歇超声（35 kHz）处理5 min，于4 ℃，10 000 r/min条件下离心30 min，获得的CCE 经0.45 μm 过滤器过滤后，于4 ℃冰箱贮存。

在1.0 mL CFS 和1.0 mL CCE 中分别添加10.0 μL 嗜水气单胞菌AHLs 粗提物，测定乳酸菌CFS 和CCE 对嗜水气单胞菌AHLs 的降解活性。在25 ℃，150 r/min 条件下旋转振荡培养24 h，采用琼脂扩散法测定嗜水气单胞菌粗提物中AHLs剩余量。

1.3.8 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌和紫色杆菌的MIC 测定 采用旋转蒸发器将乙酸乙酯萃取后的乳酸菌粗提物蒸发至无乙酸乙酯气味，真空冷冻干燥制成粉末，于-18 ℃冰箱备用。用LB 液体培养基将嗜水气单胞菌3 代培养物稀释至106 CFU/mL 后，分别加入乳酸菌粗提物粉末至终质量浓度分别为16.0，12.0，8.0，6.0，4.0，2.0，0 mg/mL。以添加5.0 mL 不同质量浓度乳酸菌粗提物的处理组为试验组，以不加粗提物的LB 培养基为对照组，37 ℃静置培养24 h。通过肉眼观察无浑浊现象的试管确定MIC，每组重复3 次。

1.3.9 亚MIC 水平乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌生长的影响 将嗜水气单胞菌用LB 肉汤稀释成106CFU/mL 菌悬液。将190 μL 菌悬液加入96孔板中，再分别加入10.0 μL 的0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物，以LB 培养基作阴性对照，30 ℃培养24 h，每隔2 h 在波长595 nm处测定OD 值。

1.3.10 亚MIC 水平乳酸菌粗提物对紫色杆菌紫色杆菌素的降解 取0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水气单胞菌共培养物的上清液，采用琼脂扩散法初步检测其降解活性。

参照Rahman等[20]的方法稍作修改。将紫色杆菌培养物分别接种到0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水气单胞菌共培养物中，孵育24 h。将培养物在13 000 r/min 下离心10 min 沉淀不溶性紫色杆菌素。取沉淀物重悬于二甲基亚砜中，震荡30 s 使紫色杆菌素完全溶解，13 000 r/min 离心10 min 除去细菌细胞。利用酶标仪在波长585 nm 处测量上清液吸光度。以紫色杆菌和嗜水气单胞菌培养物作为阴性对照。按式（2）计算降解率：

式 中，ODcontrol——对照组在OD585nm值；ODQSI——乳酸菌处理组OD585nm值。

1.3.11 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌群体感应表型的影响 将0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 乳酸菌粗提物和嗜水气单胞菌的共培养物上清液分别点样到酪蛋白培养基、DNA 酶琼脂培养基、含体积分数1.0%吐温80 的LB 琼脂、含质量比1.0%淀粉的LB 琼脂、血液琼脂培养基、群集和泳动培养基表面的滤纸片上，30 ℃培养24 h 后观察乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌中蛋白酶、DNA 酶、脂肪酶、淀粉酶、溶血性、群集和泳动现象的作用结果。同时MRS 液体培养基加入相同量的嗜水气单胞菌上清液作阴性对照。

1.3.12 乳酸菌菌株鉴定

1.3.12.1 生理生化反应 挑选对嗜水气单胞菌群体感应AHLs 信号分子具有降解作用的乳酸菌菌株，参照文献[21-23]进行菌株生理生化反应。

1.3.12.2 16S rRNA 序列分析 吸取1.0 mL 乳酸菌菌株12 h 培养物上清液加到1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 离心5 min，采用DNA 快速抽提试剂盒提取菌株DNA，以16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增。正向引物为27F（5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’），反向引物为1492R（5’-TACG GYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技术公司合成。

PCR 扩增反应体系为DNA 模板1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，总体积25 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃，预变性2 min；94 ℃，变性1 min；60 ℃，退火1 min；72 ℃，延伸90 s；72 ℃，保持10 min；循环30 次，4 ℃保温。

PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察凝胶成像系统的扩增效果并照相。将扩增成功的PCR产物送至上海生物工程股份有限公司测序。测序结果经校对后与NCBI 上Genebank 数据库中己有序列进行 BLAST 比对分析，运用MEGA 5.0软件构建乳酸菌菌株系统发育进化树。

1.3.13 数据处理 采用SPSS 22.0 对试验数据进行统计学分析，数据平行3 次，采用Origin 7.5制图。

2 结果与讨论

2.1 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌的初筛

以紫色杆菌为生物传感器，采用96 孔微量板法筛选降解嗜水气单胞菌AHLs 的结果如图1所示，156 株乳酸菌中有56 株不产生紫色或产生量远小于对照组，表明这些菌株具有降解AHLs 活性，初筛率为35.90%。

图1 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌菌株的初筛结果Fig.1 Primary screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.2 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌的复筛

采用琼脂扩散法从初筛菌株中复筛降解活性较强的乳酸菌。由表1可知，来源于内蒙古宁城酸辣椒和安徽绩溪酸菜的菌株NNL 2-5 和AJS 3-4 的降解率分别为43.71%和46.19%；来源于辽宁大连腌黄瓜的菌株DLH 513 和辽宁沈阳酸汤面的菌株STM 1-5-4 的降解率分别为 53.12%和71.11%；来源于辽宁锦州渤海牙鲆肠道的菌株YP 4-1-1 几乎无紫色晕圈产生，表明其降解活性最强，接近100%。从结果可以看出不同来源的乳酸菌降解AHLs 活性差异性很大，选择菌株YP 4-1-1 进行后续的淬灭作用研究。

表1 降解嗜水气单胞菌AHLs 乳酸菌菌株的复筛结果Table 1 Re-screening of lactic acid bacteria strains degrading A.hydrophila AHLs

2.3 YP 4-1-1 降解嗜水气单胞菌AHLs 活性

采用GC-MS 测定菌株YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌AHLs 信号分子降解活性。由表2可知，YP 4-1-1 粗提物对C4-HSL 和C6-HSL2类分子的降解率分别为98.31%和81.81%，说明其对C4-HSL 的降解活性显著高C6-HSL。介导嗜水气单胞菌群体感应的AHLs 信号分子由多种成分构成，而对C4-HSL 和C6-HSL2类主要分子的降解作用基本可反映菌株YP 4-1-1 的降解作用，该结果与琼脂扩散法基本一致，后续试验均选择YP 4-1-1 进行。

表2 YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌AHLs 信号分子的降解作用Table 2 Degradation of A.hydrophila AHLs signaling molecules by YP 4-1-1 crude extracts

2.4 YP 4-1-1 群体感应淬灭酶及其活性位置分析

YP 4-1-1 群体感应淬灭酶及其活性位置分析结果见图2。酸性条件将会导致AHLs 内酯环在其先前被内酯酶打开的情况下发生自身重组，其中由图2a可知，在pH 7.0 和pH 2.0 下，与对照组相比，YP 4-1-1 处理组皆无紫色晕圈产生，并且培养物酸化后AHLs 浓度没有恢复即无紫色圈产生，说明pH 2.0 时酶的活性没有恢复，表明具有降解作用的不是AHLs-内酯酶，可能是AHLs-酰基转移酶或氧化还原酶。由图2b可知，菌株YP 4-1-1 的CCE 对嗜水气单胞菌AHLs 具有降解活性，而菌株YP 4-1-1 的CFS 和阴性对照MRS 培养基相比，具有一定降解活性，但不显著，表明在CCE可溶性部分中存在具有QQ 活性的酶。

图2 YP 4-1-1 的群体感应淬灭酶及其活性位置分析Fig.2 Quorum quenching enzyme and its active position of YP 4-1-1 analysis

2.5 YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌和紫色杆菌的MIC

菌株YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌和紫色杆菌的MIC 分别为2.0 mg/mL 和4.0 mg/mL。为了不影响菌株生长，菌株YP 4-1-1 粗提物选择3个亚MIC 即0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC 进行后续研究。

2.6 嗜水气单胞菌和紫色杆菌的生长曲线分析

由图3可知，与MRS 培养基相比，经0.25 MIC，0.50 MIC，0.75 MIC3 个亚MIC 的YP 4-1-1粗提物处理后的嗜水气单胞菌和紫色杆菌的生长曲线处于同一生长水平，表明亚MIC 的YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌和紫色杆菌生长没有抑制作用。

图3 YP 4-1-1 粗提物对紫色杆菌CV026（a）和嗜水气单胞菌LY-2（b）生长曲线的影响Fig.3 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on growth curves of C.violaceum CV026（a）and A.hydrophila LY-2（b）

2.7 YP 4-1-1 粗提物对紫色杆菌素的降解作用

YP 4-1-1 粗提物对紫色杆菌素降解作用的琼脂扩散结果如图4a所示。由图4a可知，随着YP 4-1-1 粗提物质量浓度升高，紫色晕圈的直径逐渐减小，说明其对紫色杆菌素的降解作用越强。YP 4-1-1 粗提物对液体培养基中紫色杆菌素降解结果如图4b所示。由图4b可知，YP 4-1-1 粗提物的质量浓度越高对紫色杆菌素的降解作用越强，并且具有质量浓度依赖性。说明YP 4-1-1 粗提物在亚MIC 条件下对紫色杆菌QS 介导的紫色杆菌素有较好的降解作用。

图4 YP 4-1-1 对紫色杆菌素的降解作用Fig.4 Degradation of purple bacillus by YP 4-1-1

2.8 YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌群体感应表型的影响

采用0.0，1.0，2.0，3.0 mg/mL 的菌株YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌部分生物表型的作用结果如图5所示。图5a～d是YP 4-1-1 粗提物对淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和DNA 酶水解活性影响，当质量浓度为3.0 mg/mL 时，几乎均不产生水解圈，其余2 个质量浓度对其活性影响不显著，由此看出，乳酸菌粗提物可抑制嗜水气单胞菌4种酶的产生。

YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌溶血性的影响如图5e所示，溶血圈的大小随着YP 4-1-1粗提物质量浓度的增大而减小，由此看出，乳酸菌粗提物可显著抑制嗜水气单胞菌溶血性的产生，降低其致病性。

由图5f可知，与对照组相比乳酸菌粗提物处理组嗜铁素的生成量显著降低。乳酸菌粗提物处理组的黄色圈明显小于空白组，随着乳酸菌粗提质量物浓度的增大，黄色圈的直径逐渐减小，说明乳酸菌粗提物能够有效抑制嗜水气单胞菌嗜铁素的产生进而使其致病能力减弱。

乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌泳动和群集的影响如图5g～h所示。随着乳酸菌粗提物质量浓度的增加，嗜水气单胞菌迁移直径均呈逐渐下降的趋势。

图5 YP 4-1-1 粗提物对嗜水气单胞菌部分表型的影响Fig.5 Effects of YP 4-1-1 crude extraction on virulent factor of A.hydrophila LY-2

2.9 乳酸菌菌株鉴定

菌株YP 4-1-1 的生理生化反应结果如表3所示，依照文献[22-23]可初步断定菌株YP 4-1-1为清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）。

表3 菌株YP 4-1-1 的生理生化鉴定结果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain YP 4-1-1

图6 菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因扩增电泳图Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain YP 4-1-1

图6是菌株YP 4-1-1 的16S rRNA 基因扩增电泳图。由图6可知可以看出菌株YP 4-1-1核酸序列在1 400 bp 左右出现特异性亮带，表明目标片段被成功扩增，扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将菌株测序结果与NCBI 数据库中已知序列比对，构建系统发育进化树，结果如图7所示。由图7可知，菌株YP 4-1-1与清酒乳杆菌MG669329.1 在同一个分支上，置信度为99%，因此菌株YP 4-1-1 被鉴定为清酒乳杆菌，该结果与生理生化鉴定结果相同。

3 结论

本文从传统发酵食品以及海水鱼肠道中筛选出一株对嗜水气单胞菌AHLs 信号分子具有降解作用的菌株YP 4-1-1，对嗜水气单胞菌C4-HSL，C6-HSL 信号分子的降解活性接近100%，YP 4-1-1 酶解AHLs 活性初步鉴定不是AHLs-内酯酶的作用，可能是AHLs-酰基转移酶或氧化还原酶的作用。经生理生化反应和16S rRNA 序列分析确定菌株YP 4-1-1 为清酒乳杆菌。在体外共培养试验中，菌株YP 4-1-1可减弱嗜水气单胞菌多种毒力因子的表达。本文从传统发酵食品以及海水鱼肠道中获得对革兰氏阴性菌AHLs 具有降解活性的乳酸菌菌株，为控制由AHLs 介导的革兰氏阴性菌群体感应机制研究提供借鉴与参考，也为实现通过群体感应淬灭作用控制革兰氏阴性菌导致的疾病提出一条新的思路。

图7 菌株YP 4-1-1 的系统发育进化树Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain YP 4-1-1