富硒鼠李糖乳杆菌稳定性及其冻干保护剂研究

徐 颖 贺 黎 吕嘉枥 余海霞 王雪莹

（陕西科技大学食品与生物工程学院 西安710021）

有机硒较无机硒吸收利用率高且毒副作用小，然而，人工合成有机硒技术难度大，成本高。以乳酸菌为载体，将无机硒转化成有机硒是一个有效的微生物转化途径。富硒乳酸菌具有抗菌[1-2]，抗氧化[3]，抗癌[4]等生物活性，近年来引起广泛关注[5-9]。然而，微生物在多次连续传代中容易发生退化，遗传稳定性可能发生改变，导致其生理、生化特征变化，从而使菌株质量下降。富硒乳酸菌如果作为长期连续使用的产业化菌种，不仅应具备优异的益生特性，还应具备较好的稳定性。近年来，乳酸菌富硒菌种的筛选及发酵工艺研究取得显著成果[10-14]，而对富硒乳酸菌传代稳定性的研究较少。本试验着重研究富硒能力较强的鼠李糖乳杆菌的传代稳定性，优化富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂的配比。这对于开发富硒产品和为食品提供硒源，具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠李糖乳杆菌Lr-1 和Lr-2 均由陕西科技大学食品与生物工程学院微生物实验室提供；亚硒酸钠，山东西亚化学工业有限公司；MRS 培养基，北京奥博星生物有限责任公司；海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸钠，上海源叶生物科技有限公司；木糖醇，西安皓源生物技术有限公司；麦芽糊精，山东西王糖业有限公司，其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

722E 型分光光度计，上海光谱仪器有限公司；IRIS Intreid II 电感耦合等离子发射光谱，美国Thermofisher 公司；VEGA-3-SBH 扫描电镜-能谱仪，捷克TESCAN 公司；FD5-series 真空冷冻干燥机，美国FREEZE DRYER 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鼠李糖乳杆菌富硒稳定性研究

1.3.1．1 菌种活化 为提高菌种的活力，将菌株接种到液体MRS 培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，连续活化3 代。

1.3.1．2 生长曲线的绘制 将活化好的第3 代菌按体积分数1%的接种量接种于液体培养基中，于37 ℃条件下培养，每隔3 h 在波长600 nm 处测定吸光值。

1.3.1．3 菌株传代培养 将活化至第3 代的菌液，以1%的接种量接种于液体MRS 培养基中。为了确保菌种在传代过程中的稳定性，每次将菌株培养至稳定期时再进行转接。

乳酸菌以二分裂的方式增殖，即经过n 次分裂增殖后细菌数为2n个。在每个培养周期内，菌体以100 倍增殖，即每个培养周期内的生长代数为log2100 ≈6.64 代（24 h 即为6.64 代，1 个月可以传到200 代）[15]。

1.3.1.4 扫描电镜观察生长周期末活菌数变化取20 mL 菌悬液于3 500 r/min 条件下离心10 min 得菌体，置于1.5 mL 离心管中，加入2.5%的戊二醛，在37 ℃下固定4 h，磷酸缓冲溶液（pH 7.2）清洗3 次后，梯度乙醇脱水，并加入等体积的乙酸异戊酯置换乙醇，每次持续20 min。弃去乙酸异戊酯，将样品于-20 ℃条件下预冻12 h 后冻干。对样品喷金后，于扫描电镜-能量色散X 射线光谱仪下观察菌体表面状态。

在菌株传代过程中，每培养50 代测定各个菌株在培养周期末（24 h）的活菌数。样品经生理盐水倍比稀释到合适梯度后，采用MRS 固体培养基平皿倾注法，于37 ℃厌氧培养48 h 后计菌落总数，选取菌落数在30～300 之间的平板作为活菌总数测定的指标。

1.3.2 富硒培养 按体积比为1%的接种量将菌液接种于MRS 肉汤液体培养基，于第6 h 加入亚硒酸钠母液1 mL，使亚硒酸钠质量浓度为10 μg/mL，于37 ℃培养24 h。3 500 r/min 条件下离心10 min 得菌体，用生理盐水洗涤菌体2 次，50 ℃烘干至恒重。用电感耦合等离子发射光谱（ICP-OES）法[13]测定菌株富硒量和硒转化率。富硒量和硒转化率分别按式（1）和（2）计算：

1.3.3 富硒乳酸菌冻干保护剂配比优化

1.3.3.1 富硒乳酸菌冻干工艺流程 菌种活化→菌种富硒培养→离心收集菌体→生理盐水清洗菌体→按料液比1∶5 添加保护剂溶液→预冻→真空冷冻干燥（24 h）→原体积复水→活菌计数→计算活菌率。

1.3.3.2 富硒乳酸菌冻干保护剂配比单因素试验如表1所示，本试验共选取5种常用乳酸菌冻干保护剂，查阅相关文献给出的保护剂质量分数范围，设置质量分数梯度进行单因素试验，测定c1、c2，冻干存活率R 按式（3）计算[16]：

表1 富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂单因素试验Table 1 Single factor experiments of lyophilized protectant of selenium-enriched Lactobacillus rhamnosus

1.3.3.3 响应面法优化富硒乳酸菌冻干保护剂配比 综合单因素试验的结果，选取其中3种对冻干存活率影响显著的保护剂，设计三因素三水平试验，采用Design-Expert 软件对试验数据进行回归分析，优化富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配比。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌生长曲线的绘制

由图1可知，鼠李糖乳杆菌Lr-1 和Lr-2 生长情况良好，延滞期很短，很快进入对数期，在12 h 进入对数末期，21 h 进入稳定期，为方便试验，确定传代培养周期为24 h。由图2可知，2 株鼠李糖乳杆菌生长过程中不断产生乳酸，pH 逐渐降低，培养18 h 后pH 基本稳定在4.1～4.2 范围内。

2.2 鼠李糖乳杆菌传代过程中生长状况

由图3可知，鼠李糖乳杆菌在连续传代第7，14，21，28，35 天时，活菌数出现先增多后减少的现象，但不同代数间差距较小，由于菌株传代过程中难免会有部分菌株死亡，导致活菌数出现波动。总体来看，鼠李糖乳杆菌Lr-1 和Lr-2 在0～250代期间，活菌数变化处于动态稳定状态。

2.3 扫描电镜结果分析

由图4可知，2 株鼠李糖乳杆菌均呈短杆状，排列紧密，传代过程中菌株形态未发生明显变化，说明鼠李糖乳杆菌具有传代稳定性。

图1 2 株鼠李糖乳杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of two strains of Lactobacillus rhamnosus

图2 2 株鼠李糖乳杆菌生长过程中pH 的变化Fig.2 Changes on pH of two strains of Lactobacillus rhamnosus during growth

2.4 鼠李糖乳杆菌传代过程中富硒情况

由表2可知，2 株鼠李糖乳杆菌在0～250 代期间，富硒量和硒转化率有所波动，但不显著（P＞0.05），Lr-1 平均富硒量为429.99 μg/g，平均硒转化率为28.32%；Lr-2 平均富硒量为398.14 μg/g，平均硒转化率为25.57%。表明鼠李糖乳杆菌富硒能力在传代过程中并未发生退化，并且菌株Lr-1的富硒能力略优于Lr-2（故冻干保护剂研究中以菌株Lr-1 为主）。本研究由于受时间等因素限制，未能考察传250 代以上的情况，这需要后续试验进一步研究。

2.5 富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂单因素试验结果

由图5可知，添加海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸钠3种冻干保护剂时，富硒鼠李糖乳杆菌冻干存活率较高，海藻糖质量分数为7%时冻干存活率最高为67%、谷氨酸钠质量分数为5%时冻干存活率最高为53%、脱脂乳粉质量分数为10%时冻干存活率最高为45%；麦芽糊精和木糖醇冻干保护效果弱些，麦芽糊精质量分数为7%时冻干存活率最高为32%、木糖醇质量分数为0.75%时冻干存活率最高为26%。

表2 2 株鼠李糖乳杆菌富硒能力变化Table 2 Changes on selenium-enriched capacity of two strains of Lactobacillus rhamnosus

海藻糖、麦芽糊精、木糖醇等可代替水分子与细胞膜磷脂双分子层产生氢键而起到保护细胞膜的作用[17]。此外，还可以维持相变温度的稳定，保持磷脂双分子层的通透性，防止细胞在脱水干燥、贮存期间发生内溶物泄漏[18-19]。脱脂乳粉属于蛋白质类保护剂，通过在细胞外形成蛋白膜，降低相变温度，增加细胞膜刚性和流动性，减少在冻干期间细胞的损伤和死亡[20]。Corveleyn等[21]研究了谷氨酸钠在鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和肠球菌冷冻干燥过程中的作用，发现谷氨酸钠明显提高了菌株冻干存活率。张国强[22]用2种单糖（葡萄糖、果糖）、4种双糖（麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖）、1种多糖（葡聚糖）、2种醇类（山梨醇、甘露醇）和谷氨酸钠作酒酒球菌SD-2a 的冻干保护剂，发现2.5%谷氨酸钠效果最好，冻干存活率达（69.5±2.7）%。

图5 富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂单因素试验Fig.5 Single factor experiments of lyophilized protectant of selenium-enriched Lactobacillus rhamnosus

2.6 响应面法优化乳酸菌冻干保护剂配比结果

综合单因素试验的结果，采用响应面法，依据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，对乳酸菌冻干保护剂配比进行优化，选择添加保护剂为海藻酸钠、脱脂乳粉、谷氨酸钠3 个因素进行考察。响应面试验各因素水平表如表3所示，试验设计方案及结果如表4所示。

表3 试验各因素水平表Table 3 Test factors and levels

表4 响应面试验设计方案及结果Table 4 Response surface test design plan and results

2.6.1 回归模型的建立及显著性分析 运用Design-Expert 8.0.6 软件，对多项式回归分析，得到的二次回归方程为：冻干存活率=90.08-0.14A-1.75B+0.31C+1.10AB-2.73AC+1.40BC-1.10A2-3.83B2-4.05C2

由上式可以看出，在各因素对冻干存活率的影响中，一次项的偏回归方程系数的绝对值从大到小依次为B＞C＞A，说明加脱脂乳粉质量分数对冻干存活率的影响最大，其次是谷氨酸钠质量分数，而海藻糖质量分数的影响最小。回归模型的方差分析如表5所示。

由表5可知，在用回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R2＝0.993），Prob＞F 值（0.0006）小于0.01，方程极其显著，由此证明该试验方法是可靠的，可用于富硒乳酸菌冻干保护剂配比优化试验设计模型。失拟项表示试验预测值与实测值不拟合的概率，也就反映了拟合出来的模型与试验数据的接近程度，其Prob＞F（0.7675）大于0.05，不显著，表示回归模型适合，试验数据可靠，分析的结果可靠。

2.6.2 富硒鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配比优化结果 通过Design-Expert 8.0.6 软件进行分析，得到的富硒鼠李糖乳杆菌最佳冻干保护剂配比为：海藻糖质量分数为7%、脱脂乳粉质量分数为10%、谷氨酸钠质量分数为5%。为了验证试验结果与实际情况是否一致，根据上述试验结果添加冻干保护剂，所得到的冻干存活率，重复3 次计算平均值，得到冻干存活率为89.85%，与预期的结果90.08%相近，说明优化结果可靠。添加冻干保护剂的冻干存活率比不加冻干保护剂时提高81.85%。

表5 回归模型的方差分析表Table 5 Analysis of variance for regression model

3 结论

鼠李糖乳杆菌Lr-1 和Lr-2 在传代250 代以内，菌株形态未发生明显变化，富硒能力较稳定未发生退化，从5种冻干保护剂中优化出富硒鼠李糖乳杆菌Lr-1 最佳冻干保护剂配比为海藻糖7%、脱脂乳粉10%、谷氨酸钠5%，富硒鼠李糖乳杆菌冻干存活率可达89.86%。本文对于开发富硒产品，为食品提供硒源，具有十分重要的意义。后续试验还可以进一步考察传代250 代以上的富硒鼠李糖乳杆菌稳定性及其富硒能力，使本研究更加完善。