万古霉素修饰玻片用于金黄色葡萄球菌的表面增强拉曼光谱检测*

邰秋园，屈晓君，赵艳丰，柏婷婷，郭志睿，朱叶飞

(1.南京医科大学第二附属医院检验医学中心，南京210011；2.南京市溧水区人民医院检验科，南京 211200)

拉曼光谱技术是一种光散射技术，因其具有快速、实时、无损伤、易于操作、受水分干扰小等优势，在临床微生物检测领域具有很大的应用潜力[1]。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman spectroscopy, SERS)利用拉曼光谱技术与纳米技术结合，能增强其光谱强度达103～106倍[2]，克服了拉曼光谱信号微弱的不足[3]。上世纪末，Efrima等[4]首次描述了大肠埃希菌的SERS光谱，开启了利用SERS技术进行微生物检测的探索。

为提高从复杂环境中检出细菌的能力，很多学者采用拉曼光谱报告分子和抗体、噬菌体等识别分子修饰金属纳米结构表面，但这些识别分子的成本高，稳定性较差，制备方法困难[5]。万古霉素作为糖肽类抗菌药物，其羧基与细菌细胞壁成分胞壁酰五肽末端D-Ala-D-Ala形成氢键复合物，从而抑制细菌细胞壁合成。因其具有稳定性好、成本低、质量可控等优点，万古霉素修饰的SERS底物可用于细菌捕获和检测[6]。

有学者利用万古霉素修饰介孔二氧化硅纳米颗粒选择性识别革兰阳性细菌[7]或者万古霉素修饰银磁性纳米颗粒快速检测金黄色葡萄球菌的SERS光谱[6]，而本研究利用万古霉素捕获细菌的特性，制作万古霉素修饰玻片基底，用于金黄色葡萄球菌的捕获及其SERS光谱的检测，以期在不需要进行体外细菌培养下，建立快速检测金黄色葡萄球菌的方法。

1 材料与方法

1.1材料 显微镜盖玻片(规格18 mm×18 mm×0.16 mm，世态公司)，氢氧化钠、无水乙醇(国药集团)，3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltrimethoxysilane，APTES，赛默飞世尔公司)，万古霉素、碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochoride purum，EDC，Sigma-Aldrich公司]，2-(N-吗啉)乙磺酸[2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid，MES，Alfa Aesar公司]，胰酪大豆胨液体培养基(trypticase soy broth，TSB，海博生物公司)，Milli-Q Reference超纯水(Merck Millipore公司)，直径约40 nm的胶体银悬浮颗粒[8](自制)。

1.2仪器 inVia激光显微拉曼光谱仪(Renishaw公司)，NICOLET 5700傅里叶红外光谱仪(Thermo公司),UV3600紫外可见分光光度计(Shimadzu公司)，Ultra Plus扫描电子显微镜(Zeiss公司)，Vitek 2细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)。

1.3菌株 金黄色葡萄球菌临床分离菌株经Vitek 2细菌鉴定仪鉴定为金黄色葡萄球菌。

1.4方法

1.4.1细菌培养 金黄色葡萄球菌在37 ℃、TSB培养基中培养12 h，取1 mL，用灭菌的PBS离心洗涤3次，最后用生理盐水配制成1麦氏浊度单位的细菌悬液，备用。

1.4.2玻片氨基化 显微镜盖玻片在250 g/L氢氧化钠溶液中浸泡30 min，使玻片表面羟基化，依次用超纯水、无水乙醇洗涤3次；再置于含有1% APTES的无水乙醇中，50 ℃温育12 h，使玻片氨基化，分别用无水乙醇、MES缓冲液洗涤3次，备用。

1.4.3万古霉素修饰玻片 万古霉素与EDC以物质的量之比1∶4溶于MES缓冲液(50 mmol/L，pH 6.0)，总体积为0.5 mL，活化15 min。将氨基化玻片置于其中，室温反应6 h后，用超纯水洗涤3次。在EDC作用下，通过万古霉素的羧基与玻片氨基共价结合，形成万古霉素修饰玻片。利用傅里叶红外光谱仪检测羟基化玻片、氨基化玻片及万古霉素修饰玻片的红外特征峰。

1.4.4玻片表面万古霉素含量测定 用紫外分光光度计分别检测0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mg/mL万古霉素溶液在260 nm波长的吸光度(A)值，建立标准曲线。检测与玻片作用前后的万古霉素溶液A变化，根据标准曲线计算玻片表面偶联万古霉素含量。

1.4.5SERS光谱检测 将制备的金黄色葡萄球菌溶液滴加于万古霉素修饰玻片及空白玻片表面，37 ℃温育1 h，PBS洗涤3次，晾干后滴加胶体银纳米悬浮液，干燥，并在扫描电子显微镜下观察玻片捕获金黄色葡萄球菌情况。用激光显微拉曼光谱仪在633 nm激光下检测空白万古霉素修饰玻片、未滴加银纳米颗粒的金黄色葡萄球菌和滴加银纳米颗粒的金黄色葡萄球的表面增强拉曼光谱。

2 结果

2.1万古霉素修饰玻片 傅里叶红外光谱仪检测结果显示，万古霉素修饰玻片在1 538 cm-1处具有苯环特征峰，与氨基化玻片在1 614 cm-1形成的氨基特征峰明显区别，见图1。偶联前后溶液中万古霉素的A差值ΔA=2.123-1.699=0.424，见图2。绘制万古霉素浓度与A的标准曲线，得到回归方程：Y=2.257X+0.126(R2=0.994，其中Y指A，X指万古霉素浓度)，见图3，将ΔA代入回归方程计算出偶联至玻片的万古霉素浓度为0.132 mg/mL，质量为0.132 mg/mL×0.5 mL=0.066 mg，进一步计算出每cm2玻片表面含有0.02 mg万古霉素。

注：a，羟基化玻片的红外光谱特征峰；b，氨基化玻片的红外光谱特征峰；c，万古霉素修饰玻片的红外光谱特征峰。

2.2玻片捕获金黄色葡萄球菌 玻片与金黄色葡萄球菌经过温育、洗涤，利用扫描电子显微镜分别对玻片的细菌捕获能力进行表征，结果显示空白玻片无细菌黏附，而万古霉素修饰玻片能够结合较多数量的金黄色葡萄球菌，见图4。

图3 不同浓度万古霉素溶液与紫外吸光度的标准曲线

注：A，未修饰万古霉素玻片；B，万古霉素修饰玻片。

2.3金黄色葡萄球菌SERS光谱的检测 选择激光显微拉曼光谱仪的633 nm激光器，对玻片表面金黄色葡萄球菌的SERS光谱进行检测。与阴性对照相比，捕获金黄色葡萄球菌后在724 cm-1、780 cm-1、1 001 cm-1、1 050 cm-1、1 100 cm-1、1 240 cm-1均出现特征峰。滴加银纳米颗粒的金黄色葡萄球菌SERS信号明显高于未滴加银纳米颗粒的金黄色葡萄球菌的SERS信号。见图5。

注：a，空白的万古霉素修饰玻片的SERS光谱；b，万古霉素修饰玻片捕获金黄色葡萄球菌的SERS光谱；c，在银纳米颗粒的增强作用下，万古霉素修饰玻片捕获金黄色葡萄球菌的SERS光谱。

3 讨论

本文制备的万古霉素修饰玻片可从细菌悬液中捕获、固定金黄色葡萄球菌，在银纳米颗粒的增强下，检测出金黄色葡萄球菌SERS光谱，与Mosier-Boss[9]所述的检测细菌SERS方法一致。在EDC的催化作用[7,10]，玻片表面成功修饰万古霉素0.02 mg/cm2，即使经3次标准洗涤，金黄色葡萄球菌仍黏附在万古霉素修饰玻片表面，而空白玻片表面无细菌黏附。这是因为万古霉素与金黄色葡萄球菌细胞壁形成的氢键作用增强了基底捕获细菌的能力。Liu等[11]也认为万古霉素修饰Ag/AAO纳米基底显著增强在液体中捕获细菌的能力。

在本实验中未捕获细菌的万古霉素修饰玻片的SERS光谱没有明显的特征峰，说明万古霉素对金黄色葡萄球菌SERS光谱的背景干扰小。同时万古霉素修饰玻片批量制备成本低、操作简便，自特异性结合金黄色葡萄球菌到检测其SERS光谱约2 h，与传统的细菌培养所需时间12～48 h相比，明显缩短细菌检测时间。因此，万古霉素因其特异性、富集性、干扰性小、受水分子影响小等优点，可以从溶液中直接富集金黄色葡萄球菌，并在不损坏细菌结构的情况下进行细菌SERS光谱的检测，为直接从人体体液标本中捕获细菌并建立细菌SERS光谱奠定方法基础。

本实验检测到金黄色葡萄球菌在724 cm-1、780 cm-1、1 001 cm-1、1 050 cm-1、1 100 cm-1、1 240 cm-1具有明显的特征峰。细菌细胞壁肽聚糖主要由N-乙酰胞壁酸(NAG)、N-乙酰葡萄糖胺(NAM)和L-氨基酸组成。Avci等[12]认为724 cm-1归属富含N-乙酰胞壁酸的特征峰，1 240 cm-1归属酰胺Ⅲ，1 001 cm-1、1 050 cm-1归属苯丙氨酸。当然细菌SERS光谱的起源尚有争议，多数学者认为细菌SERS光谱特征主要归因于细菌细胞壁(肽聚糖、脂多糖、膜蛋白等)和细胞内小分子的排泄[13-14]。Premasiri等[15]认为细菌SERS光谱是由细菌分泌的代谢产物而非细胞壁成分引起。从我们观察到的金黄色葡萄球菌SERS特征峰，更倾向认为细菌的SERS光谱起源于细菌细胞壁。

但因细菌SERS光谱影响因素较多，会因实验条件的不同而有明显的改变，如SERS活性底物和激发波长、细菌的生长周期及生长环境等都会影响SERS光谱的检测[9]。因此，利用表面增强拉曼光谱仪检测细菌光谱时需要建立同质化、标准化的实验条件以及各类细菌的标准SERS光谱图谱库，以便SERS运用于细菌的鉴定。