MALDI-TOF MS对醋酸钙鲍曼不动杆菌复合群菌种鉴定效果的分析

蔡壬辛，蓝锴，屈平华，罗强，陈茶，张伟铮

(广东省中医院/广州中医药大学附属第二医院检验科，广州 510006)

醋酸钙不动杆菌-鲍曼不动杆菌复合群(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplex)又称为鲍曼不动杆菌复合群，包括鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)、医院不动杆菌(Acinetobacternosocomialis)、塞弗特不动杆菌和戴克肖不动杆菌，各菌种因表型相似，生化试验无法区分。研究发现，鲍曼不动杆菌复合群不同菌种对抗菌药物的耐药性存在差异[1]，因此将该复合群准确鉴定至种对临床用药有指导意义。Vitek MALDI-TOF MS升级至3.2版本后可鉴定鲍曼不动杆菌、医院不动杆菌和皮特不动杆菌。本研究旨在验证该版本对临床分离鲍曼不动杆菌复合群鉴定的准确性以及评估各种间的药敏结果差异性。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集广东省中医院2018年1月至2020年3月临床分离非重复鲍曼不动杆菌复合群菌株280株，样本分布包括痰液207株、尿液28株、引流液16株、分泌物13株、血液6株、脓液4株和其他6株。所有菌株经Vitek 2全自动细菌鉴定/药敏分析仪鉴定。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853来源于广东省临床检验中心。

1.2主要仪器和试剂 Vitek MALDI-TOF MS仪(V 3.2)、Vitek 2全自动细菌鉴定药敏分析仪及配套GN335药敏卡、质谱基质液(Vitek MS CHCA Matrix)、大肠埃希菌ATCC 8739(法国生物梅里埃公司)，96孔基因扩增仪(美国ABI公司)，金属浴仪(杭州博日公司)，电泳仪及凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；血平板、M-H平板(江门凯林公司)，抗菌药物药敏纸片(英国Oxoid公司)，PCR试剂(日本TaKaRa公司)，引物合成及测序(上海生工广州公司)。

1.3gyrB序列扩增及测序分析 煮沸法提取细菌DNA：用接种环挑取血平板上单个菌落接种于3 mL LB肉汤中，37 ℃ 180 r/min过夜；取1.5 mL菌液12 000 r/min 5 min，弃上清液；加入1 mL生理盐水洗涤后12 000 r/min 5 min，弃上清液。加双蒸水500 μL，混匀后于95 ℃ 10 min，12 000 r/min 5 min，上清液即为细菌DNA模板。参考文献[2]方法进行gyrB序列扩增及测序分析。gyrB引物序列包括F：5′-CCAACHGATATWCAYCCWGAAG-3′和R：5′-TCTTTTTCYTGACAGTCNGCCA-3′。PCR反应体系为25 μL：2×premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。扩增产物送上海生工广州公司进行单向测序，测序结果在NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行BLAST分析。序列比对用DNAman软件进行。

1.4Vitek MALDI-TOF MS鉴定 将鲍曼不动杆菌复合群保存菌株转种于血平板，35 ℃培养18～24 h；挑取单个菌落，均匀涂布于靶板上，随即在每个靶板孔中加入1 μL质谱基质液，待自然风干后上机鉴定。用3.2版本数据库进行结果判读，当鉴定结果选项仅有1个且可信度在60%～99.9%时为可接受的鉴定结果。大肠埃希菌ATCC 8739为质控菌株。

1.5药敏试验 用Vitek 2全自动微生物分析系统进行药敏试验，K-B法进行头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南药敏试验。大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853为质控菌株。参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2020版判读标准[3]。

1.6统计学分析 用WHONET 5.6进行药敏数据统计，用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料用率表示，率的比较用卡方检验和Fisher精确概率检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1gyrB序列扩增及测序结果 280株鲍曼不动杆菌复合群菌株经gyrB基因序列分析，可分为鲍曼不动杆菌251株、医院不动杆菌15株和皮特不动杆菌14株。gyrB可变区序列间差异采用DNAman软件比对，379～1 019 bp是gyrB基因高度可变区，可实现3种菌种鉴别。电泳图谱和序列分析分别见图1和图2。

注：M，DL2000 marker；1、2，鲍曼不动杆菌；3、4，医院不动杆菌；5、6，皮特不动杆菌；7，阴性对照；8，阳性对照。

注：序列右侧的数值，碱基在测序序列中的位置；consensus，比对碱基的一致性。

2.2鲍曼不动杆菌复合群质谱鉴定结果 280株鲍曼不动杆菌复合群菌株经质谱鉴定，分别为鲍曼不动杆菌251株、医院不动杆菌15株和皮特不动杆菌14株。与测序鉴定结果一致。

2.3药敏结果 鲍曼不动杆菌对多种临床常用抗菌药物的耐药率在60%以上，对复方磺胺甲噁唑、阿米卡星和米诺环素的耐药率较低，分别为49.4%、19.8%和11.1%。医院不动杆菌和皮特不动杆菌对常用抗菌药物均保持较高的敏感性，其耐药率明显低于鲍曼不动杆菌，差异有统计学意义(P<0.05)。医院不动杆菌与皮特不动杆菌对常用抗菌药物耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 常见抗菌药物耐药情况

3 讨论

本研究结果显示，Vitek MS(V3.2)对鲍曼不动杆菌、医院不动杆菌和皮特不动杆菌的鉴定准确率为100%，提示Vitek MS可快速准确将鲍曼不动杆菌复合群鉴定至种。本研究未检出醋酸钙不动杆菌、塞弗特不动杆菌和戴克肖不动杆菌，可能与纳入菌株数量偏少有关。有研究显示，醋酸钙不动杆菌多为环境菌株，塞弗特不动杆菌和戴克肖不动杆菌在临床亦偶见报道[4-5]，目前尚未见运用质谱技术对塞弗特不动杆菌和戴克肖不动杆菌鉴定的研究。因此，质谱对群内其他种的鉴定能力还有待评估。

本研究中皮特不动杆菌和医院不动杆菌的检出率约为5%，与国内报道相一致[6]，而欧美国家血流感染鲍曼不动杆菌复合群菌种构成中皮特不动杆菌和医院不动杆菌分离率超过50%[7]。由此可见，皮特不动杆菌和医院不动杆菌的临床检出存在地区差异。本研究中251株鲍曼不动杆菌对绝大多数药物均具有较高耐药性，仅对阿米卡星和米诺环素有一定的敏感性。而医院不动杆菌与皮特不动杆菌对大部分检测药物呈现敏感。虽然二者对头孢曲松、复方磺胺甲噁唑、阿米卡星、米诺环素的耐药率与鲍曼不动杆菌相差较大，但差异无统计学意义，后续研究将扩大菌株数量进一步验证。鲍曼不动杆菌复合群不同菌种间的耐药谱存在较大差异，质谱技术可实现鲍曼不动杆菌复合群内种的鉴定，对临床经验性用药具有较好的指导作用。