总25-羟基维生素D磁微粒化学发光免疫分析法的建立及性能评价*

卜玲，姚孝明，张誉严，韩霜，李光

(1. 南京医科大学附属老年医院检验科，南京210024；2. 南京中医药大学附属中西医结合医院 江苏省中医药研究院检验科，南京210028；3. 江南大学生物工程学院，江苏无锡214122)

维生素D是一种人体必需的脂溶性类固醇[1]，具有生物惰性，必须经过羟基化步骤去激活。在人体内，其存在2种形式：维生素D3和维生素D2。人体只能合成维生素D3，而维生素D2需要通过外界诸如食品、片剂等来补充。血清中总25-羟基维生素D(25-OH Vitamin D,25-OH VD)浓度为25-OH VD2和25-OH VD3的浓度之和[2-4]。因此，其血液浓度可用于评估总体维生素D的状态。

目前的25-OH VD检测方法学以液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和ELISA法为主。ELISA法易实现自动化操作，适合于在常规临床实验室开展，但对基质敏感，容易与其他非目标化合物发生交叉反应，降低检测的特异性，且酶促反应的结果受到反应温度、反应时间及加样准确性等因素的影响[5-6]，检测速度相对较慢。LC-MS/MS被公认为检测的金标准[7]，也被作为其他检测方法验证校对的参考依据，具有非常高的灵敏度、特异性和准确性，但仪器昂贵、对操作人员专业度要求较高，且需要自行开发检测方法。目前国内大多数医院没有配备相关仪器和专业人员的能力，限制了LC-MS/MS法在临床的应用推广。

化学发光免疫分析是将发光反应与免疫反应相结合，用来检测微量抗原或抗体的新型标记免疫检测技术[8]，具有稳定性强，重复性好，灵敏度高，特异性强，检测速度快等优点。因此本研究通过化学发光平台，建立一种检测25-OH VD的磁微粒化学发光免疫分析法。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 MULTISKAN FC酶联仪(美国赛默飞世尔公司)；SMART 6500全自动化学发光免疫分析仪(重庆科斯迈公司)。比对试剂：25羟基维生素D检测试剂盒[ELISA法，英国Immunodiagnostic Systems(IDS)公司]。

1.2主要原材料 25-OH VD单克隆抗体(英国Bioventix公司)，25-OH VD衍生物(厦门同仁心公司)，25-OH VD抗原、过碘酸钠、NHS-Biotin、EDC(美国Sigma公司)，硼氢化钠(上海麦克林公司)，25-OH VD解离液(上海汉尊公司)，链霉亲和素磁微粒(美国GE公司)，碱性磷酸酶(瑞士罗氏公司)，3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)发光底物液(美国贝克曼公司)。

1.3方法

1.3.1实验流程与原理 用竞争法，首先用25-OH VD解离液90 μL将30 μL样本中的25-OH VD从结合蛋白中解离，震荡反应90 min，形成游离态。与生物素化25-OH VD衍生物共同竞争结合碱性磷酸酶标记的25-OH VD单克隆抗体，37 ℃反应40 min后，再将生物素化25-OH VD衍生物结合至链霉亲和素磁珠上，37 ℃反应30 min后，形成抗体-抗原衍生物-磁珠的复合物，最后在电磁场中对标记抗体-抗原衍生物-磁珠的复合物进行分离洗涤，弃上清，用250 μL洗液洗涤3次后加入AMPPD发光剂200 μL，室温避光放置20 min后，用全自动化学发光免疫分析仪检测发光强度，根据化学发光强度的变化测定25-OH VD浓度，竞争法中样本浓度与发光强度呈反比。

1.3.225-OH VD校准品的溯源 使用商品化的25-OH VD抗原纯品作为原料配制校准品(0 ng/mL、6.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL)，对建立的方法进行溯源。用SMART 6500全自动化学发光免疫分析仪对标准品进行赋值，绘制标准曲线。用校准品配制成已知不同浓度的质控标本，进行结果验证，并对常规标本进行检测，验证检验结果的准确性。

1.3.3碱性磷酸酶标记抗体的制备 参考杜晔等[9]使用碱性磷酸酶标记抗体的方法，并作如下改良：(1)将2 mg碱性磷酸酶溶于1 mL 0.1 mol/L pH 8.0的碳酸氢钠缓冲液中；(2)加入500 μL 0.2 mol/L的过碘酸钠并轻轻混匀，4 ℃避光反应30 min；(3)加入1.5 mL 0.1 mol/L乙二醇，轻轻混匀后4 ℃避光反应45 min，终止氧化反应；(4)加入1 mg抗体，再加入150 μL 0.5 mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液，在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中4 ℃避光透析过夜；(5)加入1 mg NaBH4，4 ℃避光反应2 h；(6)在0.01 mol/L pH 7.2 PBS溶液中4 ℃透析24 h；(7)取出透析物，在4 ℃、3 000×g条件下离心30 min取上清液，用蛋白质浓度测定仪测定其蛋白质浓度为1.1 mg/mL；(8)加入等体积甘油，-20 ℃避光保存。

1.3.4生物素化25-OH VD衍生物的制备 (1)用无水二甲基甲酰胺(DMF)将NHS-Biotin溶解至1 mg/mL，分装保存于-20 ℃备用；(2)取500 μL 2 mg/mL的25-OH VD衍生物溶液，加入5倍于25-OH VD衍生物物质的量的NHS-Biotin(1 mg/mL)，并用0.5 mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液将反应总体积补足至1 mL，室温反应1 h；(3)在0.1 mol/L PBS缓冲液透析中4 ℃透析24 h；(4)取出透析物，用蛋白质浓度测定仪测定其蛋白质浓度为5.8 mg/mL；(5)加入等体积甘油，-20 ℃避光保存。

1.3.5试剂最佳工作浓度 用棋盘滴定法，将标记抗体稀释为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和6.0 μg/mL 4个浓度，将生物素化25-OH VD衍生物稀释为25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL 3个浓度，分别交叉测试。用25-OH VD纯品，配制0浓度样本(S0)和91.5 ng/mL的高值样本(S1)进行筛选。

2 实验与结果

2.1校准品的赋值 根据ELISA法已知的线性范围，配制校准品浓度为0 ng/mL、6.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL，经赋值后的校准曲线见图1。

2.2试剂最佳工作浓度的确定 当S1与S0的信号值之比(抑制率)小于10%，说明该组试剂浓度下的样品可以拉开较大梯度。当标记抗体浓度为1.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物浓度为25 ng/mL，标记抗体浓度为2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物浓度为25 ng/mL，标记抗体浓度为1.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物浓度为50 ng/mL，标记抗体浓度为2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物浓度为50 ng/mL时，S1与S0的信号值之比(抑制率)小于10%。同时，标记抗体浓度为2.0 μg/mL、生物素化25-OH VD衍生物浓度为50 ng/mL时S1与S0的信号值的绝对值又大于抑制率小于10%的另外3组，样品之间有更宽的信号空间，故选择该组试剂浓度为最佳工作浓度。见表1。

图1 25-OH VD校准曲线

表1 25-OH VD试剂最佳工作浓度确定

2.3性能验证

2.3.1准确度 用25-OH VD纯品配制高值98.75 ng/mL和低值3.17 ng/mL 2个浓度的检测样本，进行连续测定，每天对高水平和低水平样本进行3次重复测定，连续测定5 d。分别取测试结果均值，计算相对偏差。结果显示，相对偏差分别为-2.09%、-0.63%，均在±10%范围内，证明建立的方法准确度符合行业标准要求。

2.3.3线性试验 根据NCCLS EP6-A2文件[11]，用25-OH VD纯品配制高值98.75 ng/mL和低值3.17 ng/mL 2个浓度的检测样本，按体积比1∶5、2∶4、3∶3、4∶2、5∶1混合成5个浓度梯度，作为预测值。将每个浓度样本重复测定3次，计算其平均值作为实测浓度，将平均值(X)和预测值(Y)作线性回归分析。建立的方法在3.17～98.75 ng/mL内实测值与预测值之间线性关系良好(Y=0.975 8X+0.517 7，r2=0.999 9)。见表2。

表2 25-OH VD线性试验结果

2.3.4干扰试验 根据CLSI EP7-A2[12]文件实验方案，将配制好的同稀释浓度干扰测试样本重复检测2次，用低、中、高3个浓度水平的样本作为基础样本，将每个基础样本分为5份，其中一份加入不含干扰物的样本稀释液为对照样本，另外4份中加入等体积的不同浓度干扰物质作为分析样本，每份样本重复测定3次取平均值，计算干扰率。干扰率=(分析样本测定浓度平均值-基础样本测定浓度平均值)/基础样本测定浓度平均值×100%。计算添加干扰物后与无干扰物时的干扰效应，以偏倚≤10%为判断标准。结果显示，当生物素浓度为250 nmol/L、三酰甘油浓度为1 500 mg/dL、血红蛋白浓度为1 500 mg/dL、胆红素浓度为200 mg/dL时，干扰率均小于8%，说明本方法的抗干扰能力较强。见表3。

表3 25-OH VD干扰试验结果

2.3.5稳定性 将生物素化25-OH VD衍生物-20 ℃避光保存，碱性磷酸酶标记的25-OH VD单克隆抗体4 ℃避光保存，3个浓度的检测样本(浓度分别为6.5 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL)-20 ℃保存。首次测定后，分别于7、14、21、30 d进行测定，每个样品重复测定3次，求得平均值。以首次测定结果(0 d)为标准，计算稳定性，以90%～110%作为试剂稳定的评价标准。25-OH VD化学发光法检测试剂在4 ℃条件下21 d内稳定性均在90%～110%内，具有较好的稳定性，21 d后25-OH VD稳定性明显下降。见表4。

表4 25-OH VD稳定性(%)

2.3.6准确度方法学比对 根据NCCLS EP9-A2[13]文件实验方案，由江苏省省级机关医院提供200例临床样本，同时使用比对方法(ELISA法)和建立的方法进行测定，以ELISA法所测结果为X轴，本文方法所测结果为Y轴，进行回归分析。回归方程为Y=1.006 2X-0.166 3，r2=0.9792。对截距a和斜率b分别作t检验，由200例样本数查得95%置信区间t0.05/2=1.972，ta=-0.3542<1.972，说明截距a无限接近于0，无统计学意义；tb=94.310 7>1.972，说明斜率b不等于0，有统计学意义。说明两者的测定结果有良好的一致性。

3 讨论

维生素D是人体必须的脂溶性维生素。在儿童中，严重缺乏会导致佝偻病；在中老年人中，缺乏维生素D会导致骨质疏松，易引发骨折等问题。此外，有研究表明，25-OH VD还与糖尿病、癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病有关[14-16]，大剂量补充维生素D的维生素D匮乏人群来说，更需要定期监测体内25-OH VD的含量以防过量导致中毒[17]，因此准确监测25-OH VD的总量至关重要。

本文建立的方法采用全自动化学发光免疫分析仪，且使用生物素-链霉亲和素信号放大体系，使25-OH VD的测定更便捷、快速,灵敏度更高。本研究对准确度、精密度、线性、干扰、稳定性和方法学比对进行了系统研究。其中，准确度偏差和批内、批间精密度均小于10%，满足临床需求，具有较好的重现性及可靠性；在3.17～98.75 ng/mL之间测量值与靶值之间线性良好；在生物素浓度不大于250 nmol/L、三酰甘油浓度不大于1 500 mg/dL、血红蛋白浓度不大于1 500 mg/dL、胆红素浓度不大于200 mg/dL等干扰下，不产生明显干扰作用。研究表明，分别用ELISA法和金标准LC-MS/MS法进行25-OH VD的方法比对，结果发现LC-MS/MS法测定的25-OH VD数值明显低于ELISA法，表明ELISA法低估了体内维生素D的缺乏，但保证严格实验条件下，ELISA法可作为筛查25-OH VD的方法，且ELISA法与LC-MS/MS法具有较好的相关性，可经公式方程互换[18]。鉴于ELISA法在常规临床实验室的广泛使用，因此，我们将本文建立的方法与英国IDS公司开发的25-OH VD检测试剂盒(ELISA法)同时测定200例临床样本，比对结果表明2种方法结果具有较好的相关性。磁微粒化学发光免疫分析法具有稳定性强，重复性好等优点，克服了ELISA法结果受反应温度、反时间及加样等因素影响的缺陷，并且省时、快速。

综上所述，本研究建立的25-OH VD磁微粒化学发光免疫分析法可应用于临床定量检测人血清中25-OH VD的含量，其准确度、精密度、线性、抗干扰能力以及稳定性均满足临床要求。