牙龈卟啉单胞菌感染增加食管鳞状细胞癌的化疗抵抗

任 超，杨海军，张耀文，原 翔，刘怡文，高社干，周福有

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivahs,Pg)感染与口腔癌的发生是近年来一大研究热点[1-2]。因为口腔上皮与食管上皮均为鳞状上皮，且口腔与食管物理距离上的链接以及吞咽习惯等因素均可使食管上皮成为Pg的寄居地并进而可能诱发加重食管癌的发生发展[3-4]。本研究团队前期研究报道了Pg的感染与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)临床病理特征及生存预后的关系，提出Pg感染与食管鳞癌的发生发展有关[5-6]。但Pg感染是否影响ESCC的疗效尚未见文献报道，本研究围绕Pg感染与ESCC患者临床病理特征和化疗敏感性的相关性进行，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年1月至2018年12月安阳市肿瘤医院需行新辅助化疗的ESCC患者，化疗方案：紫杉醇+顺铂(紫杉醇135 mg·m-2，静脉滴注，仅用于第一天；顺铂 75 mg·m-2，静脉滴注，分3 d输注，21 d为1周期)，共进行2周期。休息3～4周后行手术治疗。纳入标准：共100例，其中男性61例，女性39例；年龄<60岁28例，≥60岁72例；经免疫组化染色确认Pg感染与否；Pg阳性者47例为观察组，Pg阴性者53例为对照组。排除标准：治疗前行放疗、生物及免疫治疗，严重的基础疾病，预计生存期<0.5 a。收集并统计所有患者一般临床资料，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移、临床分期、化疗后疗效评价[RECIST疗效评价标准(2000)；统一使用CT评效]、化疗后肿瘤组织病理反应及预后。该项目经过安阳市肿瘤医院伦理委员会审核同意。

1.2 材料免疫组化SP超敏试剂盒购于中杉金桥公司，HRP标记山羊抗兔IgG抗体购于康为公司，山羊抗兔IgG(H+L)荧光抗体购于CST公司。

1.3 方法病理标本4 μm厚连续切片，进行免疫组织化学SP法染色观察。根据切片中细胞质及细胞核着色的阳性细胞数以及着色面积进行评分，在组织切片内随机挑选5个高倍镜视野(200倍或400倍)，对组织切片的染色强度和染色面积进行半定量分析。染色强度评分标准为：0分，未着色，阴性；1分，着色较弱，呈浅黄色，弱阳性；2分，中性着色，呈棕黄色，中度阳性；3分，着色较强，呈棕褐色，强阳性。染色面积评分标准为：阳性细胞占0%～5%，0分；阳性细胞占6%～25%，1分；阳性细胞占25%～75%，2分；阳性细胞>75%，3分。免疫组化评分计算方法：总得分=染色强度×染色面积。0分，-，阴性；1～3分，+，弱阳性；4～8分，++，中阳性；9～12分，+++，强阳性。实验结果统计标准：0分为阴性，>1分为阳性。

1.4 统计学方法使用SPSS 23.0软件进行统计学数据分析。计数资料以百分率(%)表示，两组数据组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化SP法检测100例ESCC组织中Pg的表达Pg阳性着色定位于ESCC癌细胞的细胞质中，呈棕黄色颗粒，见图1。Pg阳性共47例，阳性率为47.00%。

A、B、C：Pg阳性；D：Pg阴性

2.2 Pg感染与ESCC临床病理特征和化疗疗效的相关性Pg感染情况与肿瘤发病年龄、肿瘤浸润深度、肿瘤淋巴结转移、化疗后疗效评价、化疗后肿瘤组织反应程度存在显著相关性(TNM分期采用AJCC第八版的食管癌分期)。见表1。

表1 Pg感染与食管鳞癌临床病理特征的相关性 例(%)

2.2.1 Pg感染与ESCC患者年龄相关性分析对100例ESCC患者患病年龄进行相关性分析，<60岁28例，Pg阳性20例，占71.43%；≥60岁72例，Pg阳性27例，占37.50%；Pg阴性27例，占62.50%。Pg阳性表达率在<60岁组显著高于≥60岁组(χ2=9.316，P=0.002)。

2.2.2 Pg感染与ESCC浸润深度相关性分析对100例ESCC肿瘤浸润深度进行相关性分析，浸润在纤维膜以下组(黏膜层、肌层；即T1+T2)患者共38例，Pg阳性5例，占13.16%；达到及超过纤维膜组(T3+T4)患者共62例，Pg阳性42例，占67.74%。Pg阳性表达率在T3+T4组显著高于T1+T2组(χ2=28.179，P=0.001)。

2.2.3 Pg感染与ESCC淋巴结转移相关性分析对100例ESCC局部淋巴结转移情况进行相关性分析，有淋巴结转移组(N+)患者共59例，Pg阳性38例，占64.41%；无淋巴结转移组(N0)患者共41例，Pg阳性9例，占21.95%。Pg阳性表达率在N+分期中组显著高于N0组(χ2=17.504，P=0.001)。

2.2.4 Pg感染与ESCC化疗后疗效评价相关性分析参照RECIST疗效评价标准(2000)，统一使用CT评估，对100例ESCC患者化疗后疗效评价情况进行相关性分析，疗效评价达PR/CR组患者共45例，Pg阳性14例，占31.11%；疗效评价达SD/PD组患者共55例，Pg阳性33例，占60.00%。Pg阳性表达率在PD/SD组中显著高于CR/PR组(χ2=8.292，P=0.004)。

2.2.5 Pg感染与ESCC化疗后肿瘤组织病理反应相关性分析对100例ESCC化疗后肿瘤组织病理反应情况进行相关性分析，病理反应轻度患者共65例，Pg阳性43例，占66.15%；病理反应中/重度患者共35例，Pg感染阳性4例，占11.43%。Pg阳性表达率在化疗后肿瘤组织病理反应轻度组中显著高于病理反应中/重度组(χ2=27.352，P=0.004)。

3 讨论

肿瘤是机体在多种致癌因素相互作用下，原癌基因被激活，凋亡调节基因和修复基因被改变，致使细胞凋亡受到抑制，使其克隆性异常增生而形成的。目前关于感染与肿瘤的相关研究是肿瘤学的一大热点，而其中关于Pg促进恶性肿瘤发生发展的研究也越来越多。Pg能够抑制宿主细胞凋亡，并且能够改变局部炎症环境的致病作用[2,7]；Pg对黏膜具有黏附和侵入性，进入上皮细胞后可逃避宿主免疫系统的打击，在细胞内进行繁殖，进而可在细胞之间进行传播[8]；Pg可通过分泌毒素和激活细胞内特定的信号传导通路对细胞的程序性死亡进行抑制；Pg可诱使环氧化酶2和血管内皮生长因子的表达增加，增加肿瘤新生血管形成，有利于肿瘤的局部浸润和转移[7]；Pg还可以通过间接作用，抑制自然杀伤T细胞的功能，有利于肿瘤细胞逃脱自身免疫系统的攻击，有利于肿瘤细胞的增殖与淋巴结转移[8-9]。2016年高社干等[5,10]率先检测出ESCC中Pg感染显著高于癌旁组织，并采用高通量测序法(next-generation sequencing technology,NGS)证实了ESCC癌组织中Pg丰度显著高于正常黏膜组和健康组，还证实了Pg感染可影响化疗药物对食管癌细胞的杀灭效果，但Pg在临床上是否确实影响ESCC的化疗疗效，尚未得到研究证实。

本实验结果显示：Pg感染情况与肿瘤发病年龄、肿瘤浸润深度、肿瘤淋巴结转移、化疗后疗效评价、化疗后肿瘤组织反应程度存在显著相关性。化疗后疗效评价PD/SD组中Pg阳性表达率60.00%，显著高于疗效评价CR/PR组的31.11%，化疗后肿瘤组织病理反应轻度组中Pg阳性表达率66.15%，显著高于病理反应中/重度组的11.43%，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究结果表明：Pg感染可能促进了ESCC的发展；Pg感染阳性者，化疗敏感性较差，即Pg感染增加了ESCC的化疗抵抗。在倡导恶性肿瘤精准治疗的大环境之下，检测Pg感染将可能为ESCC化疗选择提供一种生物学指标，是否可采取对Pg感染阴性的ESCC患者行化疗，而对Pg感染阳性的ESCC患者先行抗Pg治疗后再行化疗，或联合抗Pg治疗和化疗,值得进一步深入研究。