牙龈卟啉单胞菌促进模型鼠口腔鳞癌发展

刘其伟，焦叶林，陈 攀，阮豪杰，许海军，谷变利，刘 轲，齐义军，张旭明，高社干

90%以上口腔恶性肿瘤起源于鳞状上皮细胞，因此，口腔癌主要指口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)。OSCC在最常见恶性肿瘤中排名第六，至少50%的OSCC起源于舌[1]。流行病学研究已鉴定了多个与OSCC相关的危险因素，包括年龄、遗传、饮食、抽烟、饮酒等，但确切的发病因素仍不清楚[2]。近年来，许多研究已证实细菌感染能够增加某些肿瘤的罹患风险，如幽门螺杆菌和胃癌[3]，感染可使罹患胃癌风险增加2.7～12倍。人类口腔微生物组包括至少700种不同种类细菌，其中44%在体外分离培养并已命名，这些微生物构成了复杂的口腔微生态[4]。正常生理状态下，口腔微生态保持动态平衡，平衡紊乱可直接损伤邻近组织或通过异常免疫反应间接损伤远处组织，导致人体多种疾病发生发展。口腔微生态平衡紊乱与多种疾病的发生发展关系密切。目前研究认为口腔关键致病菌卟啉单胞菌属和梭状杆菌属的数量异常增加是造成口腔局部微生态失衡的重要原因之一[5]。与相邻非癌组织相比，OSCC组织中发现了大量卟啉单胞菌和梭状杆菌属的细菌。本研究鼠上颌磨牙进行丝线结扎制备牙周炎，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4-NQO)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)共同作用诱导C56BL/6鼠OSCC发生发展[6]，探讨P.gingivalis在鼠OSCC形成及进展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组24只6周龄、体质量(19±0.5) g的C57BL/6雄鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。动物房温度26 ℃，所有鼠适应1周、4种抗生素联合处理2周后，分为4组每组6只，分别为对照组、P.gingivalis诱导牙周炎组、4-NQO组、P.gingivalis诱导牙周炎和4-NQO联合处理组。对照组鼠常规喂饲，第8至10周牙周炎组鼠上颌第二磨牙丝线结扎，每周2次P.gingivalis口腔涂抹感染诱导牙周炎；4-NQO组、4-NQO和P.gingivalis联合组给予8周4-NQO处理(50 μg·mL-1)。所有鼠喂饲或处理至30周时，颈椎脱臼处死。

1.2 主要试剂配制4种抗生素联合喂饲浓度：0.1 g·L-1万古霉素，0.2 g·L-1甲硝唑、新霉素和氨苄青霉素；丙二醇配制4-NQO储存液的浓度为5 mg·mL-1(4 ℃避光保存)。

1.3 制备C57BL/6鼠牙周炎6 μL·g-120%乌拉坦溶液(Sigma，货号U2500-100G)通过鼠腹腔给药，浓度为6 μL·g-1。鼠麻醉成功后，显微镜下丝线结扎鼠左右上颌第二磨牙，实验过程中如有丝线脱落，及时补扎。将对数生长期P.gingivalis细菌用2%羧甲基纤维素配制为2×1010·mL-1，每只鼠给予50 μL口腔涂抹，尤其是上颌磨牙区，每周2次，处理18周。

1.4 小鼠饲养及样本采集整个实验过程中观察记录小鼠饮水进食、体质量、活动行为等变化，30周颈椎脱臼处死所有鼠，解剖分离舌组织，肉眼检查记录舌黏膜表面增生、感染、出血等病变后，福尔马林溶液固定、常规脱水、包埋、切片，HE染色。

1.5 数据处理采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理分析，小鼠体质量变化比较采用方差分析，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 建模及实验方案为了阐明慢性感染在口腔鳞癌的发病机制，本研究结合小鼠牙周炎模型及4-NQO诱导口腔癌模型，设计了一个新方案(图1-2)。小鼠按照以下方案进行抗生素统一处理，8周4-NQO诱导，2周丝线结扎鼠上颌第二磨牙，随后每周2次P.gingivalis感染，30周时统一处死小鼠进行组织收集和数据分析。

图1 口腔肿瘤诱导发生示意图

图2 鼠磨牙结扎制备牙周炎模型示意图

2.2 实验过程中小鼠体质量变化图3显示18、22、26、30周时各组小鼠的体质量，其中对照组和P.gingivalis组在各时间点上平均体质量变化不明显，平均体质量约为30 g。18周时4-NQO组和4-NQO联合P.gingivalis组体质量开始下降，随着实验进展，这两组鼠体质量逐渐降低。30周时鼠舌肿瘤明显增大、影响进食，处死各组小鼠。实验结束时4-NQO组平均体质量为23.67 g，4-NQO联合P.gingivalis组降低显著、体质量最轻，平均体质量为22.55 g，与对照组和P.gingivalis组相比有统计学差异(P<0.05)。

图3 18、22、26周和30周时各组实验鼠体质量

2.3 舌表面变化随着实验进展、4-NQO作用和P.gingivalis感染时间的延长，小鼠舌黏膜相继出现白色斑块、乳头状增生及菜花样改变并逐渐增大，但4-NQO联合P.gingivalis组鼠的病变较4-NQO单纯处理组严重，实验结束时，4-NQO联合P.gingivalis组鼠舌黏膜全部可见不规则乳头状增生或菜花样改变，4-NQO单纯处理组仅有2只出现上述改变。对照组和P.gingivalis组鼠在整个实验过程中，舌黏膜呈粉红色、舌乳头分布均匀，舌体柔软，无白色斑块及菜花样改变。见图4。

图4 30周时小鼠舌体大体观

2.4 舌组织学变化舌组织HE染色可见，30周时对照组和P.gingivalis组上皮完整，基底细胞大小均一、排列整齐，未见明显细胞增生。4-NQO联合P.gingivalis组鼠可见体积增大的癌细胞、排列不规则、异型性明显，癌变细胞浸润至舌肌全层。4-NQO联合P.gingivalis组鼠的上述各种病变均较4-NQO单纯处理组严重。见图5。

图5 30周时各组实验鼠舌组织学改变

3 讨论

肿瘤的发生发展与炎症密切相关，尤其是慢性炎症，如慢性萎缩性胃炎、乙型或丙型肝炎[7-8]。在慢性炎症病灶内，存在大量的浸润炎症细胞和炎症介质，如细胞因子和趋化因子等。这些炎性介质不仅介导炎症的发生发展过程，更重要的是，它们还能够促进肿瘤细胞存活和增殖[9]。众所周知，P.gingivalis是口腔慢性牙周炎的关键致病菌，并与多种疾病发生发展相关。正常生理条件下与宿主和谐共生的微生态，在P.gingivalis存在的情况下，能够转化为具有致病性、紊乱的微生态[10]。P.gingivalis是革兰氏阴性厌氧菌，主要寄生于牙周炎患者的龈下菌斑中，是牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis感染引发局部炎症反应，通过炎症细胞和炎症因子的作用，损伤破坏牙周组织，慢性感染还导致牙槽骨吸收，最终使牙齿脱落[11]。虽然口腔是P.gingivalis常见的定植部位，其他多种组织中也能够检测到P.gingivalis，如咽喉、食管、肺、动脉粥样硬化斑块、阿尔茨海默病脑组织等[12]。这些结果表明，P.gingivalis能够适应多种组织微环境，通过多种机制逃逸炎症反应及免疫系统的杀伤作用。近年来多项流行病学研究发现，P.gingivalis与OSCC之间具有密切联系[13]，提示P.gingivalis具有致癌潜能。

本课题组前期应用qPCR和免疫组化分析了食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和癌旁组织中P.gingivalis的丰度，发现癌组织中P.gingivalis丰度明显高于癌旁组织，并且癌组织中P.gingivalis富集程度与ESCC低分化、淋巴结转移和预后不良具有明显相关性[14]，提示P.gingivalis感染能够促进ESCC进展。由于口腔和食管解剖位置毗邻，组织结构相同，于是设计本研究。本研究应用4-NQO诱导的鼠口腔鳞癌模型进一步证实了P.gingivalis能够显著缩短4-NQO诱导的鼠OSCC发生历程，这些富集的P.gingivalis来源于鼠牙周炎中P.gingivalis感染。OSCC发生过程中，舌黏膜经历上皮异常增生、原位癌、浸润性鳞癌等一系列连续的细胞表型和组织结构的异常变化。随着癌细胞恶性程度增加，原位癌继续发展为浸润癌，最终形成远处器官转移。本研究发现，P.gingivalis能够显著促进OSCC早期阶段癌前病变的发生和进展。通过饮水给予实验组鼠中等剂量的4-NQO(50 μg·mL-1)8周，其后20周正常喂饲[15]，30周时部分鼠舌黏膜发生病变(发病率33%)。然而，浓度为50 μg·mL-1的4-NQO预处理8周，再通过口腔牙周炎感染P.gingivalis，30周时P.gingivalis联合4-NQO处理组鼠舌黏膜全部可见乳头状或菜花状增生病灶(发病率100%)。由此可见，P.gingivalis明显增加了鼠OSCC发病率，而4-NQO单独处理组的鼠舌各种病变显著低于联合处理组。

本研究表明P.gingivalis引发的牙周炎促进了4-NQO诱导的C57BL/6鼠舌鳞状细胞癌的发生发展，提示P.gingivalis是口腔癌发生发展的危险因素之一，深入探讨P.gingivalis参与口腔癌变过程的分子机制，可为口腔癌的预防和靶向治疗提供新途径。