黑木耳寡糖在嗜酸乳杆菌微胶囊中的作用

何荣军，刘高丹，项群然，孙培龙

(浙江工业大学 食品科学与工程学院，浙江 杭州 310014)

益生菌可以调节肠道菌群，给宿主的健康带来益处，但其在加工储藏和通过胃肠道时活菌数会大幅度减少，很难达到国际乳联标准化委员会规定的益生菌产品中活菌数要≥106CFU/mL(g)的规定[1-2]。因此，在胁迫环境中如何提高菌体抗性已经成为近年来研究的热点[3]。益生菌微囊化技术是将益生菌包裹在微小且封闭的胶囊中，使微胶囊既能抵御胃液的刺激，又能在肠道有效释放，温和且稳定[4-5]。

黑木耳属担子菌纲，木耳目，木耳科，含有多糖和低聚糖等功效成分，具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、延缓衰老等作用[6-7]。大量研究表明，以低聚糖类益生元(如菊粉、低聚半乳糖和低聚果糖等)[8]作为壁材添加到益生菌微胶囊中，其在体外模拟胃肠液和贮藏性能实验中都表现出很好的活性[9]。本研究将黑木耳低聚糖用于嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌和植物乳杆菌的培养，筛选出益生效果最好的菌种，同时将黑木耳低聚糖应用于复合微胶囊的壁材中，制备肠溶性复合微胶囊，并探究其形态特征、耐胃酸情况、肠道定点释放情况以及储藏稳定性情况。这对扩大黑木耳低聚糖的应用范围以及改进肠道益生菌的包埋技术具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳子实体干品，吉得利食品有限公司；AB-8大孔树脂，天津市鼎盛鑫化工有限公司；冻干型益生菌粉，山东中科嘉亿生物工程有限公司；菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和葡萄糖，山东保龄宝生物技术有限公司；乳清蛋白和转谷氨酰胺酶(TGase)，上海源叶生物科技有限公司；大豆油，山东鲁花集团有限公司；胃蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶，美国Sigma公司。

1.2 主要仪器设备

真空冷冻干燥机，美国Virtis公司；紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；高速分散机，德国ULTRA-TURRAX公司；动态散射粒径与Zeta电位分析仪，美国Brookhaven公司；场发射扫描电子显微镜，日本Hitachi公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳低聚糖的制备

根据前期的预实验结果，黑木耳子实体按固液比1∶30在90 ℃恒温水浴中浸提3 h，重复提取3 次，离心去渣后，加入3 倍体积的95%乙醇，静置24 h，离心得上清液，旋蒸去除乙醇，加水复溶后用AB-8大孔树脂静态吸附3 h，用95%乙醇淋洗，洗脱液经旋蒸去除乙醇后冷冻干燥密封备用[10-11]。

1.3.2 黑木耳低聚糖含量测定方法

本实验采用高浓度的乙醇进行醇沉，绝大部分的多糖、蛋白质和杂质无法溶解在上清液中，在过滤时被除去，且前期预实验表明黑木耳低聚糖中的单糖含量很低，因此低聚糖含量可用总糖含量来表示。故采用苯酚-硫酸法[12]测定其低聚糖含量。

1.3.3 菌种活化

取0.5 g益生菌菌粉溶于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，离心，用0.85%生理盐水洗涤两次，将菌体重新悬浮于20 mL 0.85%生理盐水中。将浓缩菌液的浓度调至1010CFU/g。

1.3.4 黑木耳低聚糖体外益生活性筛选

参照Li等[13]的方法，将黑木耳低聚糖、葡萄糖和常见的益生元(菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖)等作为碳源加入到5 mL MRS液体培养基中，使其最终质量浓度分别为5，10，20，30，40 g/L，灭菌冷却，分别加入40 μL植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌菌液，37 ℃厌氧厌氧培养12 h后，在600 nm处测定吸光度，无菌培养基作为空白对照，每组进行3 次平行实验。

1.3.5 益生菌低聚糖复合微胶囊的制备方法

参照Heidebach等[14]和邹强等[15]的方法，以及前期实验中得到的最优条件制备微胶囊：固化时间150 min，壁材复配比m(黑木耳低聚糖)∶m(热变性乳清蛋白)=1∶4，芯壁比(体积比)为0.075∶1。将1.5 mL的浓缩菌液与10 mL热变性(90 ℃，0.5 h)的乳清蛋白溶液(质量浓度为100 g/L)和10 mL质量浓度为25 g/L的黑木耳低聚糖溶液混合后，立即加入0.5 g的TGase(200 U/g)振荡混匀。将混合液加入到盛有120 mL预热至40 ℃的大豆油中。40 ℃下，1 200 r/min磁力搅拌150 min，离心(700g，5 min)，收集沉淀并用林格氏试剂(含体积分数为5%的吐温-80)清洗2 次，继续离心5 min，重新收集沉淀部分，贮存于4 ℃备用。

1.3.6 复合微胶囊的包埋率测定

参照Doherty等[16]的方法，加入4.5 mL的解囊液进行破囊，并测定嗜酸乳杆菌微胶囊的包埋率，用活菌数计算包埋率。包埋率EE的计算公式为

式中：N为每克湿胶囊中的活菌总数，CFU/g；M为总湿胶囊质量，g；N0为加入的浓缩菌液活菌总数，CFU。

1.3.7 黑木耳低聚糖对包埋率的影响

参照1.3.5中的方法，保证壁材浓度和固形物含量相同的前提下，对添加黑木耳低聚糖所制得的微胶囊(A)与不添加黑木耳低聚糖制得的微胶囊(B)进行对比，并测定包埋率，以探究黑木耳低聚糖对包埋率的影响。

1.3.8 复合微胶囊的形态测定

用场发射扫描电子显微镜(SEM)观察冷冻干燥后的复合微胶囊和喷雾干燥后的嗜酸乳杆菌菌粉(以麦芽糊精为载体)的表面结构；动态散射粒径与Zeta电位分析仪(DLS)测定冷冻干燥后的复合微胶囊(将其溶于蒸馏水中测定)平均粒径及其粒径分布。

1.3.9 复合微胶囊对模拟胃肠液的耐受性试验

参考刘欢等[17]的方法配制模拟胃液、模拟肠液和解囊液。

将0.5 mL浓缩菌液或者0.5 g复合微胶囊加入到4.5 mL模拟胃液和肠液中，在37 ℃，100 r/min条件下前者培养30，60，90，120 min，后者培养1，2，3，4 h，之后加入解囊液，振荡10 min至完全解囊后进行活菌计数，每组做3 次平行实验。

1.3.10 复合微胶囊的储藏稳定性试验

国食药监注[2005]202号文件《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》[18]中指出：活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数目不得少于6 log CFU/mL(g)。将冷冻干燥后的复合微胶囊和未包囊化的等量浓缩菌液放置于无菌的西林瓶中，封口后置于4，25 ℃环境下储藏35 d，每隔7 d进行活菌计数，每组进行3 次平行实验。

1.3.11 数据处理

实验各组数据均以均值±标准差表示；数据绘图采用Origin 2017软件和GraphPad Prism8软件。

2 结果与讨论

2.1 黑木耳低聚糖的含量及其益生效果

经测定，1.3.1提取得到的黑木耳低聚糖质量分数为(78±0.2)%。由图1(a)可知：黑木耳低聚糖和菊粉对嗜酸乳杆菌都有明显的促进增殖作用，且黑木耳低聚糖的益生效果远大于菊粉和葡萄糖，黑木耳低聚糖的益生效果随着质量浓度的增加先上升后降低，在质量浓度为20 g/L时，益生效果最好，这是由于黑木耳低聚糖到达一定质量浓度时，造成高渗透压环境，菌体细胞脱水，从而抑制了菌体生长[19]。由图1(b，c)可知：黑木耳低聚糖对鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌均无明显益生作用。由图1(d)可知：黑木耳低聚糖对植物乳杆菌有促进增殖作用，且随其质量浓度的增加先上升后降低，但其益生效果比葡糖糖差。综上所述，考虑到黑木耳低聚糖对嗜酸乳杆菌具有明显的益生效果，后续将选用嗜酸乳杆菌作为芯材制备复合微胶囊。

图1 肠道益生菌在不同碳源条件下的增殖情况Fig.1 Proliferation of intestinal probiotics under different carbon source conditions

2.2 黑木耳低聚糖对嗜酸乳杆菌包埋率的影响

实验结果表明，壁材中加入黑木耳低聚糖的微胶囊包埋率为(78.8±0.1)%，不含黑木耳低聚糖的微胶囊包埋率为(57.3±0.2)%，由此可见在微胶囊中加入黑木耳低聚糖能够显著提高复合微胶囊的包埋率。复合微胶囊的包封效果与壁材中有无黑木耳低聚糖有着重要的关系，这可能是变性乳清蛋白和黑木耳低聚糖干燥后可以形成结构紧密、无空隙、无黏连的微胶囊，将嗜酸乳杆菌包埋在其中[20]。单纯使用变性乳清蛋白作为包埋壁材形成的微胶囊易破碎，结构松散，机械强度低，易产生多孔结构[21]，活菌容易流出。加入小分子的黑木耳低聚糖可以封闭微胶囊上的细孔和裂缝[22]，从而将嗜酸乳杆菌紧密地包封在里面，在进入胃肠道后可以保护嗜酸乳杆菌免受胃酸侵蚀，在肠道溶解后黑木耳低聚糖还能作为益生元，提供嗜酸乳杆菌增值所需碳源。

2.3 复合微胶囊的包埋率和形态

采用前期实验中得到的最优条件对嗜酸乳杆菌进行包埋，制备的微胶囊包埋率为(86.8±0.2)%，活菌数为(9.7±0.2) log CFU/g。

冷冻干燥后的复合微胶囊与喷雾干燥后的嗜酸乳杆菌菌粉的扫描电镜观察结果如图2所示。由图2(a)可知：黑木耳低聚糖和变性乳清蛋白作为壁材制备的复合微胶囊结构完整，呈不规则球型聚集态，无裸露的嗜酸乳杆菌，微球与微球之间无黏连现象，表面凹凸不平，这是由于黑木耳低聚糖的高黏性而黏结在一起。复合微胶囊表面有褶皱现象但未见裂纹，这与冷冻干燥过程中水分的丧失以及壁材的表面活性有关[23]。由图2(b)可知：以麦芽糊精为载体的嗜酸乳杆菌经过喷雾干燥处理后，被包覆在麦芽糊精中，但表面裸露大量的嗜酸乳杆菌，使其易受到外界环境影响，起不到很好的保护作用，喷雾干燥后的微球形状杂乱无序，大小不均一，无黏结现象。综上所述，微胶囊化可以对嗜酸乳杆菌起到保护作用，隔绝外界不利环境。

图2 复合微胶囊与嗜酸乳杆菌菌粉的扫描电镜观察结果Fig.2 SEM observation results of compound microcapsule and Lactobacillus acidophilus powder

DLS测定结果显示(图3)，复合微胶囊的平均粒径为41.7 μm，粒径分布范围较窄，粒径大小较为均一，说明本方法制备的微胶囊大小比较均一。

图3 复合微胶囊(湿)的粒径分布Fig.3 Particle size distribution of composite microcapsules (wet)

2.4 复合微胶囊对模拟胃肠液的耐受性试验结果

由图4(a)可知：在模拟胃液环境下，复合微胶囊和浓缩菌液中的嗜酸乳杆菌的数量在120 min内持续降低，说明酸性环境对嗜酸乳杆菌有极大的破坏性[24]。在低pH条件和胃蛋白酶作用下，浓缩菌液的活菌数迅速下降直至为0，而复合微胶囊在培养30 min后虽略有下降，但逐渐稳定下来。在模拟胃液中120 min后，复合微胶囊中嗜酸乳杆菌活菌数下降了30.6%，减少量比浓缩菌液中的低约3 个数量级，包埋后的复合微胶囊相对活力损失显著降低，这与常柳依等[8]向微胶囊中添加海洋寡糖作为益生元的结果相似，这是由于变性乳清蛋白在微胶囊表面形成了保护性涂层，同时黑木耳低聚糖无法被胃液消化酶解，进而对嗜酸乳杆菌起到较好的保护作用，使嗜酸乳杆菌有很好的抗胃酸能力[25]。微胶囊中包埋的益生菌能在人体特定部位释放，对人体健康有着重要的意义[26-27]，由图4(b)可知：在模拟肠液环境下，浓缩菌液和复合微胶囊中的嗜酸乳杆菌的活菌数并未发生显著降低。浓缩菌液在未进行保护的条件下培养3 h后，活菌数下降了2 个数量级；而包埋后的复合微胶囊在1 h时反而出现活菌数增长的现象，这是由于复合微胶囊中的嗜酸乳杆菌在肠液中释放后利用黑木耳低聚糖进行增殖引起的，在肠液中4 h后，活菌数仅下降了8.4%，说明以黑木耳低聚糖为壁材制备的复合微胶囊肠溶性好，存活率高。

图4 复合微胶囊和浓缩菌液在模拟胃液和模拟肠液中的菌体存活情况Fig.4 Survival of live bacteria in simulated gastric juice and simulated intestinal juice by composite microcapsule and concentrated bacterial liquid

2.5 复合微胶囊的储藏稳定性

微胶囊在储存期间活菌数的减少主要是由于菌体细胞膜脂质的氧化，因此环境温度和微胶囊含水量是影响活菌数量的关键因素[28-29]。从图5可以看出：随着储藏时间的增长，复合微胶囊和浓缩菌液中的活菌数都处于下降状态，且浓缩菌液的下降速率比复合微胶囊的快。包埋后的嗜酸乳杆菌在储藏期间的稳定性显著增强，在4 ℃条件下储藏的复合微胶囊中的活菌数下降速率比25 ℃的慢，这是由于储存温度越高，越容易导致膜脂质的氧化，从而导致菌体死亡。在4 ℃条件下经过35 d的储藏，复合微胶囊内嗜酸乳杆菌的活菌数为(8.5±0.1) log CFU/g；在25 ℃条件下经过35 d的储藏，复合微胶囊内嗜酸乳杆菌的活菌数为(6.3±0.1) log CFU/g，均达到了《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》中活菌数目不得少于6 log CFU/mL(g)的要求[18]。

图5 复合微胶囊和浓缩菌液在4，25 ℃下的存活率变化Fig.5 Survival rate changes of composite microcapsules and concentrated bacterial liquid at 4, 25 ℃

3 结 论

根据黑木耳低聚糖对不同益生菌的益生结果，选取益生效果最好的嗜酸乳杆菌进行包埋，所得的微胶囊包埋率为86.8%，平均粒径约为41.7 μm，在扫描电镜下呈不规则球型聚集态。在复合微胶囊耐贮性试验与耐受性试验中，包埋后的益生菌对模拟胃肠液的耐受性更高，在胃液中2 h后，活菌数下降了30.9%，在肠液中4 h后，活菌数仅下降了8.4%；复合微胶囊冻干粉在4，25 ℃条件下储藏35 d后，活菌数分别为8.5，6.3 log CFU/g，均达到了益生菌类保健食品中的指标。以黑木耳低聚糖作为微胶囊新型材料，在提高微胶囊化嗜酸乳杆菌贮藏性能的同时，还能提高微胶囊服用过程中嗜酸乳杆菌对胃液的耐受性，在肠道溶解后还能作为益生菌的益生元，使嗜酸乳杆菌在肠道溶解、释放后仍能保持较好的活性。此结果为进一步开发食用菌微生态制剂提供了依据，同时对食用菌的精深加工和肠道益生菌包埋技术的探究具有重要的现实意义。