牛膝炮制品对骨质疏松斑马鱼的影响

陶 益，江恩赐，姜慧洁，颜继忠，蔡宝昌

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

斑马鱼是一种脊椎动物模型，在生物学方面，斑马鱼和人具有很多共同点，譬如斑马鱼和人共有82%药物靶点，具有相似的药物代谢酶谱[1]，目前斑马鱼已经成功地应用于药物筛选、靶标鉴定、药理学和毒理学等方面的研究[2-4]。但是，关于斑马鱼疾病模型在中药活性成分评价方面的报道仍然较少，韦英杰课题组首次提出了基于斑马鱼模型的中药代谢研究思路与方法，建立一种能体现中药作用整体观的模式生物的中药代谢研究新平台，并应用于川续断[5]、淫羊藿[6]、强骨胶囊[7]中抗骨质疏松活性成分的筛选和活性成分川续断皂苷VI、淫羊藿苷A等的代谢研究，均取得了良好的预期效果。

牛膝是常规大宗药材之一，有生牛膝和盐牛膝等炮制品种，现代研究报道其具有抗骨质疏松症作用[8-9]。传统去势大鼠骨质疏松评价模型成模周期长(1 个月)、成本高、效率低，而斑马鱼骨质疏松评价模型成模快(10 d)、成本低、效率高。大量研究证实转化生长因子-β(TGF-β)通路能调控骨形成与骨吸收的平衡，而Smad蛋白家族直接介导TGF-β通路下游的信号转导，在调节骨代谢过程中扮演重要的角色[10]。本研究探索建立斑马鱼骨质疏松模式生物模型，用于牛膝生品和盐炙品的抗骨质疏松活性评价，同时对骨质疏松斑马鱼中TGF-β/Smad信号通路蛋白水平进行Western Blot分析，为牛膝不同炮制品的抗骨质疏松症机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 斑马鱼

AB品系斑马鱼购自于南京尧顺禹生物科技有限公司。

1.1.2 试 剂

泼尼松龙、MS-222、二甲基亚砜(DMSO)、多聚甲醛和茜素红S购自上海阿拉丁生化科技有限公司；牛膝药材在河南温县收集，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为苋科植物牛膝Achyranthesbidentata的干燥根，批号20151228；盐购自江苏省盐业集团有限责任公司；一抗包括兔抗TGF-β1(1∶4 000，ab92486)，兔抗p-smad 2/3(1∶500，ab63399)，兔抗Smad 4(1∶4 000，ab40759)，兔抗Smad 7(1∶500，ab216428)和小鼠单克隆GAPDH抗体(1∶1 000)购自Abcam；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000，BA1056)或山羊抗小鼠IgG(1∶2 000，BA1101)购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3 仪 器

ZEISS宏观变倍显微镜(ZEISS，型号：Axio Zoom V16)，天能全自动化学发光成像分析系统(上海天能，型号：Tanon-5200)。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制

培养基包含5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和0.33 mmol/L MgSO4。

1.2.2 泼尼松龙储备液和工作液的配制

精密称取泼尼松龙90.6 mg，加入DMSO 20 mL，用培养基定容至100 mL，终浓度为2 500 μmol/L，作为储备液。配制工作液时，取1 mL泼尼松龙储备液，加入6 mL DMSO后，用培养基定容至100 mL，终浓度为25 μmol/L。

1.2.3 牛膝的炮制

称取2 g盐加5倍量水溶解，取牛膝段100 g，置容器内，加入盐水拌匀，密闭闷润2 h，将炒锅预热，倒入盐水闷润的牛膝，用文火炒至颜色变深，微带焦斑，取出，晾凉，得到盐牛膝备用。

1.2.4 生、盐牛膝干燥粉末的制备

称取生牛膝或盐牛膝20 g，转移到圆底烧瓶中，加入160 mL水，放入电热套中加热回流提取2 h，重复两次，合并提取液，减压冷冻干燥，得粉末备用。

1.2.5 生、盐牛膝储备液和工作液的配制

精密称取生、盐牛膝水提物干燥粉末50 mg，加入DMSO 10 mL，用培养基定容至50 mL，最终质量浓度为1 g/L，作为生、盐牛膝储备液。量取20 mL 生、盐牛膝储备液，加入1 mL 2 500 μmol/L泼尼松龙溶液，再加入6 mL DMSO，用培养基定容至100 mL，作为生、盐牛膝工作液。

1.2.6 斑马鱼骨质疏松模型的构建与生牛膝、盐牛膝防治功能的初步分析

将受精后第5天(5 dpf)的斑马鱼幼鱼分成4 组，置 6 孔板中，每组3 孔，每孔10 条幼鱼。其中一组给予0.5% DMSO，作为阴性对照，其余3 组给予25 μmol/L泼尼松龙模型药，置于恒温培养箱中28.5 ℃培养。48 h后，将其中一组的模型药替换为含25 μmol/L泼尼松龙的200 mg/L盐牛膝溶液，另一组的模型药替换为含25 μmol/L泼尼松龙的200 mg/L生牛膝溶液，每天换药，培养至第10天(10 dpf)，将各组斑马鱼取出进行固定和茜素红染色并进行骨矿化量分析。

1.2.7 斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法

将斑马鱼幼鱼培养至10 dpf，用4%多聚甲醛4 ℃固定过夜后，使用含3% H2O2的0.5% KOH将鱼体漂白40 min，然后采用溶于70%乙醇的0.01%茜素红溶液对斑马鱼幼鱼染色24 h，第2天用1% KOH脱色3 min，最后用梯度比分别为3∶1，1∶1，1∶3的1% KOH和甘油的混合溶液依次浸泡幼鱼，将幼鱼透明化。最后将幼鱼保存于纯甘油中。使用显微镜拍摄幼鱼头部腹面照。然后采用图像分析软件将幼鱼头部骨骼染色面积和累积光密度进行分析计算，以反映骨矿化量。

1.2.8 TGF-β/Smad信号通路中标志性蛋白水平变化

用PBS(pH 7.4)洗涤各组斑马鱼幼鱼两次，然后在冰冷的蛋白质裂解缓冲液中匀浆以提取蛋白质。匀浆在4 ℃下以12 000g离心15 min后，收获上清液，通过BCA蛋白试剂盒定量蛋白质的浓度。将蛋白质与上样缓冲液混合，在95 ℃下煮沸6 min使其变性。分离出40 μg总蛋白质通过5%和10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜中。在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后，将膜与一抗孵育：兔抗-TGF-β1(1∶4 000)，兔抗-p-smad 2/3(1∶500)，兔抗Smad 4(1∶4 000)，兔抗Smad 7(1∶500)和小鼠单克隆GAPDH抗体(1∶1 000)分别在4 ℃过夜。用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)或山羊抗小鼠IgG(1∶20 000)作为第二抗体检测膜1 h。通过电化学发光(ECL)试剂使蛋白质条带可视化。GAPDH用于标准化处理，通过Image J软件进行分析。

2 实验结果及分析

2.1 不同组别斑马鱼头骨发育状况分析

受精后10 d的斑马鱼不同组别的腹面头骨茜素红染色显微成像如图1所示，可见钙化的骨矿化基质部位被染成了红色。与DMSO对照组，泼尼松龙造模组茜素红染色面积显著减少。与泼尼松龙模型组相比，生、盐牛膝组染色面积有不同程度的增多，且盐牛膝组斑马鱼染色面积增加程度高于生牛膝组。

图1 不同组别斑马鱼茜素红染色的显微成像图Fig.1 Microscopic image of zebrafish after alizarin red staining in different groups

2.2 斑马鱼幼鱼头骨茜素红染色面积与累计光密度分析

如图2，3所示，与DMSO对照组相比，泼尼松龙组斑马鱼头骨矿化面积和累积光密度值，呈显著性差异(P<0.05)，这提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松模型。生、盐牛膝给药组的斑马鱼头骨矿化面积和累积光密度值较模型组均有显著提高(P<0.05)，说明生、盐牛膝可部分阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨丢失，而且盐牛膝的作用强于生牛膝。

图2 不同组别斑马鱼头骨矿化面积Fig.2 Mineralized areas of zebrafish skull in different groups

图3 不同组别斑马鱼累积光密度分析Fig.3 Cumulative optical density analysis of zebrafish skull in different groups

2.3 不同组斑马鱼中TGF-β/Smad信号通路中标志性蛋白水平

如图4, 5所示，与空白组相比，模型组斑马鱼的TGF-β1，p-Smad 2/3和Smad 4蛋白水平显著降低(P<0.05)，Smad 7蛋白水平显著上升(P<0.05)，这说明模型组斑马鱼的TGF-β/Smad信号通路受到泼尼松龙的抑制。和模型组相比，生、盐牛膝给药组的TGF-β1，p-Smad 2/3和Smad 4蛋白水平显著提高(P<0.05)，接近甚至超过正常组，而Smad 7蛋白水平显著下降(P<0.05)，但仍然高于正常组的水平，这说明生、盐牛膝给药组能够逆转模型组TGF-β/Smad信号通路的抑制作用。此外，盐牛膝组TGF-β1，p-Smad 2/3，Smad 4和Smad 7蛋白水平的变化幅度大于生牛膝组，两组有显著性差异(P<0.05)，这提示盐牛膝能够更有效地逆转泼尼松龙对TGF-β/Smad信号通路的抑制作用，更好地促进骨骼的发育生长。

图4 不同组别斑马鱼中TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 和 Smad 7 蛋白条带Fig.4 Protein bands of TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 and Smad 7 of different groups

图5 不同组别斑马鱼中TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 和 Smad 7蛋白表达水平Fig.5 Expression levels of TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 and Smad 7 in different groups of zebrafish

3 结 论

本实验主要研究生、盐牛膝提取物对斑马鱼骨质疏松模型的治疗作用，并探讨其作用机制。实验结果表明：生、盐牛膝提取物均能显著改善斑马鱼骨质疏松模型的头骨矿化面积和累积光密度，盐牛膝的改善幅度大于生牛膝提取物。同时Western Blot分析发现：生、盐牛膝提取物均能显著上调TGF-β1，p-Smad 2/3及Smad 4蛋白表达水平，下调Smad 7蛋白表达水平，盐牛膝的调控力度大于生牛膝。综上所示，生、盐牛膝提取物均有治疗骨质疏松症的作用，可能与调控TGF-β/Smad信号通路相关，此外，盐牛膝的治疗作用优于生牛膝，这也提示中药炮制具有增效作用。