响应曲面法优化木聚糖酶解法制备玉米秸秆低聚糖工艺研究

嵇 威，李饶桦，钱时权

（淮阴师范学院，生命科学学院，江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心，江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏省食品质量安全与营养功能评价重点建设实验室，江苏淮安 223300）

玉米秸秆是供作饲料为主的粮、经、饲兼用作物，同时也是农业生产的重要废弃物。我国有着极其丰富的玉米秸秆资源，每年产量达2.65 亿t 左右[1-2]，大部分被直接焚烧或还田，得不到充分的利用。玉米秸秆含有纤维素、半纤维素和木质素等大分子碳水化合物，利用木聚糖酶酶解这些大分子化合物可以进一步制备功能性低聚糖[3-5]。研究表明，功能性低聚糖可替代蔗糖广泛应用在饮料、乳制品、调味品和糖果等食品中[6-7]。目前，国内已有大量关于玉米秸秆资源在饲料、肥料、燃料、食用菌基料、工业原料等方面的开发利用报道[8-10]。尽管如此，利用木聚糖酶酶解玉米秸秆制备低聚糖的研究文献很少。

目前，农作物秸秆功能性糖的提取方法主要有热解法和酶解法。热解法得到的低聚木糖产率虽高，但高温热解过程中易产生一些对人体有害的副产物。酶解法利用木聚糖酶的专一性和高效性，能有效降解秸秆中的木聚糖形成低聚糖。以玉米秸秆为原料，研究木聚糖酶解对玉米秸秆低聚糖提取的影响，并在此基础上利用响应曲面法对玉米秸秆低聚糖酶解提取工艺进行了优化，旨在为玉米秸秆资源的高效开发利用提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

玉米秸秆，采集自淮安郊区农场；木聚糖酶（100 000 U/g）、3,5 - 二硝基水杨酸试剂、氢氧化钠、酒石酸钾纳、30%过氧化氢、硫酸亚铁、浓盐酸、水杨酸钠、水杨酸、无水乙醇、95%乙醇、氯化钠、铁氰化钾三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯化铁，均为分析纯，以上试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16C 型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；722G 型紫外可见分光光度计，上海光学仪器厂产品；FA214 型电子分析天平，上海精密仪器有限公司产品；HH 型恒温水浴锅，金坛市中大仪器厂产品；ZWY-110H 型恒温振荡器，上海智诚分析仪器制造公司产品；KH-45A 型恒温干燥箱，广州康恒仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 玉米秸秆低聚糖的提取

2.1.1 玉米秸秆木聚糖的提取

选取形态良好的玉米秸秆，晒干后粉碎，在60 ℃下烘制至恒质量，过60 目筛制成粉末。准确称取5.00 g 玉米秸秆粉末于锥形瓶中，加入100 mL 蒸馏水，加入质量分数为8%的NaOH 溶液，置于90 ℃水浴锅中蒸煮2 h，蒸煮液以转速6 000 r/min 离心10 min，收集上清液。向上清液中加入0.5 mol/L的HCl 至pH 值为6.0，再加入质量分数为5%的H2O2放置一段时间脱色处理；向脱色过后的溶液中加入3 倍体积的95%乙醇，4 ℃下醇沉12 h，以转速6 000 r/min离心10 min，收集沉淀，经真空干燥后研磨，得到玉米秸秆木聚糖粉末。

2.1.2 玉米秸秆低聚糖的制备

称取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的木聚糖酶，调节pH 值，放入恒温振荡器中加快酶解。酶解结束后，于沸水中10 min 灭酶，冷却后以转速6 000 r/min 离心10 min，收集上清液，得到玉米秸秆低聚糖溶液。按2.1.1 中的方法得到玉米秸秆低聚糖粉末备用。

2.2 玉米秸秆低聚糖提取率及平均聚合度的测定

该方法参考何亮亮[11]的方法。取1 mL 玉米秸秆低聚糖溶液于试管中，加入1.5 mL DNS 试剂，摇均后于沸水浴中保温5 min，拿出冷却至室温后定容至25 mL，取一定体积溶液于波长540 nm 处测定吸光度，以蒸馏水为对照液，平行测定3 次，取平均值。另取1 mL 玉米秸秆低聚糖溶液，加入1.5 mL DNS试剂和2 mol/L H2SO4溶液1 mL，于沸水浴中保温30 min，拿出冷却至室温后，以质量分数为20%的NaOH 溶液中和至中性，定容至25 mL，取一定体积于波长540 nm 处测定吸光度，以蒸馏水对照，平行测定3 次，取平均值。

式中：A1——加入硫酸铜前波长540 nm 处低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸铜后波长540 nm 处低聚糖溶液的吸光度；

M——玉米秸秆粉末的质量，g。

式中：A1——加入硫酸铜前波长540 nm 处低聚糖溶液的吸光度；

A2——加入硫酸铜后波长540 nm 处低聚糖溶液的吸光度。

2.3 酶解法提取玉米秸秆低聚糖单因素试验

2.3.1 酶质量分数对玉米秸秆低聚糖提取率的影响

准确称取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，在保持其他条件不变时，分别加入质量分数为1.0%，1.3%，1.5%，1.7%，1.9%，2.0%的酶，按照2.1.2和2.2 方法提取低聚糖，计算低聚糖提取率，考查酶质量分数对玉米秸秆低聚糖提取率的影响，比较不同提取率下低聚糖聚合度的差异。

2.3.2 酶解时间对玉米秸秆低聚糖提取率的影响

准确称取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，加入一定量的酶，保持其他条件不变，按酶解时间为2，4，6，8，10，12 h，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，计算低聚糖提取率，考查酶解时间对玉米秸秆低聚糖提取率的影响，比较不同提取率下低聚糖聚合度的差异。

2.3.3 pH 值对玉米秸秆低聚糖提取率的影响

准确称取0.01 g 木聚糖粉末溶解于50 mL 水中，保持其他条件不变，按照酶解时pH 值为1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，按照2.1.2 和2.2 方法提取低聚糖，计算低聚糖提取率，考查酶解时间对玉米秸秆低聚糖提取率的影响，比较不同提取率下低聚糖聚合度的差异。

2.4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，选取酶质量分数（A）、酶解时间（B） 和pH 值（C） 3 个因素，以玉米秸秆低聚糖提取率（Y） 为响应值，采用Box-behnken 试验设计方法优化玉米秸秆低聚糖提取工艺参数。

试验因素与水平设计见表1。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

表1 试验因素与水平设计

3.1.1 酶质量分数对玉米秸秆低聚糖提取率和聚合度的影响

酶质量分数对低聚糖提取率和聚合度的影响见图1。

由图1 可知，随着酶质量分数的增加，低聚糖提取率先升高后下降，最后基本不变；原因可能是反应刚开始时，木聚糖酶迅速酶解木聚糖得到较多的低聚糖，所以随着酶质量分数的增加，低聚糖含量逐渐升高，当酶质量分数增加到一定量后，会抑制反应的进行，从而导致低聚糖得率下降，最后达到新的平衡，故最后低聚糖提取率不变。从图1 同时可以看出，低聚糖的平均聚合度随着酶质量分数的增加，呈现出跟提取率相同的变化趋势，可能与酶解反应的程度有关。在酶质量分数为1.3%时，低聚糖提取率和平均聚合度达到最大。因此，酶质量分数选择1.3%为适宜。

3.1.2 酶解时间对玉米秸秆低聚糖提取率和聚合度的影响

酶解时间对低聚糖提取率和聚合度的影响见图2。

由图2 可知，玉米秸秆低聚糖提取率和平均聚合度随酶浓度增加呈现先升高后下降的趋势，原因可能是因为反应时间过长，酶的活力下降和部分低聚糖发生水解造成提取率下降和聚合度下降。在酶解时间为6 h 时低聚糖提取率和平均聚合度达到最大。因此，酶解时间为6 h 较为适宜。

3.1.3 pH 值对玉米秸秆低聚糖提取率和聚合度的影响

pH 值对低聚糖提取率和聚合度的影响见图3。

由图3 可知，随着pH 值的升高，低聚糖提取率和平均聚合度同步变化，均线上升后下降，原因是pH 值过高或过低都会使木聚糖酶失活，导致低聚糖提取率下降。低聚糖提取率在pH 值为5.0 时达到最大，此时平均聚合度也最佳，本着提高低聚糖产率的期望，pH 值为5.0 最合适。

3.2 响应面法优化玉米秸秆低聚糖提取工艺

综合分析单因素试验结果，选取酶质量分数（A）、酶解时间（B） 和pH 值（C） 为自变量，以低聚糖提取率（Y） 为响应值，进行响应面优化。

响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果

由表2 可知，建立玉米秸秆低聚糖提取率对酶浓度、酶解时间和pH 值二次多元回归方程为：

方差分析见表3。

表3 方差分析

对表2 和表3 比较分析，得到的模型（p＜0.000 1）显著，而且该模型的拟合度较好，因为失拟项不显著（p=0.748＞0.05）；R2=0.997 7，说明低聚糖提取率99.77%的变异都能通过此模型解释。在分析的结果中，其中一次项A 和C 极其显著（p＜0.000 1），表明酶质量分数和pH 值对低聚糖提取率影响极显著。同时，交互项（AB、AC、BC） 和二次项（A2、B2、C2） 对提取率的影响也都极为显著（p＜0.01）。由F值大小可知，影响玉米秸秆低聚糖提取率主要因素主次顺序为A＞C＞B，即酶质量分数＞pH 值＞酶解时间。

3.3 响应面分析

根据回归方程，得出酶质量分数、酶解时间和pH 值对低聚糖提取率影响的响应面图和等高线图。

酶质量分数和酶解时间交互作用对低聚糖提取率的影响见图4。

由图4 可知，当固定条件为pH 值时，另外2 个因素酶质量分数和酶解时间逐渐升高时，玉米秸秆低聚糖的提取率，表现为先升高后降低的趋势。

酶质量分数和pH 值交互作用对低聚糖提取率的影响见图5。

由图5 可知，当固定条件为酶解时间时，酶质量分数和pH 值对低聚糖提取率交互作用对提取率的影响极为显著，表现为随着酶质量分数和pH 值的升高先升高后下降。

酶解时间和pH 值交互作用对低聚糖提取率的影响见图6。

由图6 可知，当固定条件为酶质量分数时，低聚糖提取率随酶解时间和pH 值的变化而变化，表现为随酶解时间和pH 值的增大先上升后下降，由响应面图和等高线图可知，当低聚糖提取率达到一定值后不再增加[12]。

通过回归模型和响应曲面法对参数的最优化分析，得出酶解法制取玉米秸秆低聚糖的最佳条件为酶质量分数1.3%，酶解时间6.12 h，pH 值5.45，在此工艺条件下，得到低聚糖提取率的最大预测值为59.3%。考虑到实际操作情况，对最佳条件进行了适当调整：酶质量分数1.3%，酶解时间6.12 h，pH 值5.40，在此工艺条件下进行3 次重复试验，得到玉米秸秆低聚糖的实际提取率为59.24%，平均误差为1.13% （n=3），试验值与理论值基本吻合。以上结果表明，所获得的模型能有效用于玉米秸秆低聚糖提取。

4 结论

采用了酶解法提取玉米秸秆低聚糖，研究了酶质量分数、酶解时间、pH 值对玉米秸秆低聚糖提取率的影响，并考查了低聚糖的平均聚合度；采用响应曲面法优化了酶解法提取玉米秸秆低聚糖的工艺条件。结果表明，酶质量分数、酶解时间和pH 值对低聚糖提取有显著影响。得到酶解法制备玉米秸秆低聚糖的最佳工艺条件为酶质量分数1.3%，酶解时间6 h，pH 值5.40，在此条件下玉米秸秆低聚糖的提取率为59.24%。