lncRNA MIAT在巨噬细胞炎症反应中的作用①

王子叶 杨 堃 温大蔚 赵 磊 王吉波

(青岛大学附属医院风湿免疫科，青岛 216000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜关节慢性炎症为主要临床表现的系统性疾病[1]。近年研究提出巨噬细胞为RA病理生理核心炎症细胞，涉及RA的各个阶段，尤其是RA早期。巨噬细胞激活后产生大量炎症细胞因子和趋化因子如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)和IL-1β，导致RA炎症过程[2]。对巨噬细胞炎症反应机制的探讨有助于进一步明确RA发病机制，探索新的治疗靶点。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是长度在200 bp以上，不具备编码蛋白功能的RNA[3]。许多证据表明lncRNAs参与机体的多种生物过程，包括炎症反应[4]。近年lncRNAs在风湿免疫性疾病如系统性红斑狼疮、RA中的作用也引起众多关注[3，5-7]。lncRNA 心肌梗死相关转录本(lncRNA myocardial infarction associated transcript，lncRNA MIAT)是一种主要表达于心肌细胞和肾脏细胞、具有调控蛋白合成功能的lncRNA。Fagerberg等[8]利用芯片技术对人体组织和器官进行转录组学分析发现，lncRNA MIAT在骨髓中高表达，说明骨髓是lncRNA MIAT的主要作用场所之一。此外，lncRNA MIAT在多种疾病的发生中扮演重要角色，主要与炎症反应的激活相关[9]。骨髓内以单核巨噬细胞为主的炎症细胞浸润增加导致的骨髓水肿被认为是RA的早期主要病理表现之一，且长期持续存在于RA各阶段[10]。因而推测lncRNA MIAT可能与骨髓巨噬细胞的炎症反应有关进而影响RA发病。本文旨在研究lncRNA MIAT在小鼠巨噬细胞J774A.1中的作用及其可能作用的炎症通路，为进一步探究lncRNA MIAT在RA骨髓巨噬细胞炎症反应中的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠来源巨噬细胞J774A.1(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；DMEM高糖培养基(HyClone，美国)；胎牛血清(fatal bovine serun,FBS;Gibco,美国);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS;Sigma，美国)；ERK5特异性抑制剂ERK5-IN-2(MCE，美国)；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO；索莱宝，北京)；shNC/MIAT 质粒(吉玛基因，上海)；TRIzol，real time-qPCR试剂盒(TaKaRa，大连)；引物(华大基因，深圳)；核质分离试剂盒(Invitrogen，美国)；PVDF膜(Millipore，德国)；BCA试剂盒(碧云天，中国)；RIPA(10X)、蛋白酶抑制剂Cocktail、GAPDH、NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3、磷酸化-NF-κB、磷酸化-ERK1/2、磷酸化-ERK5、磷酸化-STAT3一抗和HRP-山羊抗兔二抗(CST，美国)；ECL发光液(Thermo Scientific，美国)；小鼠来源IL-1β、TNF-αELISA试剂盒(eBioscience，美国)；LightCyclerTM480 Ⅱ qPCR仪(Roche，瑞士)；电泳转膜设备、显影仪、荧光酶标仪(Bio-Rad，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及炎症反应细胞模型的制备 含10% FBS的DMEM培养液用于培养小鼠来源巨噬细胞J774A.1，细胞密度达80%～90%时传代，传代比例1∶3。取生长状态良好、对数生长期细胞进行后续实验。

用100 ng/ml的LPS刺激J774A.1细胞制备炎症反应细胞模型(LPS组)，以等体积PBS刺激的J774A.1细胞为对照组(PBS组)，继续培养进行后续实验。

在炎症反应细胞模型中加入ERK5-IN-2作为抑制剂组，以ERK5-IN-2溶解液DMSO作为对照，继续培养进行后续实验。

1.2.2质粒转染 预冷PBS物理吹打法解离对数生长期J774A.1细胞，以8×104～1×105个/孔均匀铺于24孔板中，细胞密度达70%～90%时行脂质体质粒转染，转染shMIAT质粒为敲低(knock-down，KD)组，转染shNC 质粒为阴性对照(negative control，NC)组。

1.2.3分离提取细胞总RNA、细胞核质DNA及RT-qPCR检测 TRIzol法分别提取LPS组、PBS组、KD组、NC组、ERK5-IN-2组和DMSO组J774A.1细胞的总RNA。用核质分离试剂盒对LPS组及PBS组的细胞进行核质分离，分别提取细胞核、细胞质RNA。将RNA逆转录成cDNA，按SYBR Premix TaqⅡ试剂盒配制20 μl反应体系：TB Green 10 μl、cDNA 2 μl、上游引物1.6 μl(5 μmol/L)、下游引物1.6 μl(5 μmol/L)、RNase free 水 4.8 μl。反应条件如下：95℃预变性30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环复性；94℃ 90 s、60℃ 180 s延伸，绘制扩增曲线。以GAPDH为细胞总RNA及细胞质RNA的内参基因，U6为细胞核RNA的内参基因，由2- ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.4Western blot检测蛋白表达 RIPA裂解液提取KD组、NC组、ERK5-IN-2组和DMSO组J774A.1细胞总蛋白,BCA试剂盒用于测定蛋白质浓度。上样缓冲液经100℃变性10 min后行SDS-PAGE电泳(80 V 30 min，120 V 1 h)，转膜(290 mA 90 min)，5% BSA封闭1 h，加GAPDH 抗体(1∶1 000)、NF-κB抗体(1∶1 000)、ERK 1/2抗体(1∶1 000)、ERK5抗体、STAT3抗体(1∶1 000)、p-NF-κB抗体(1∶2 000)、p-ERK1/2抗体(1∶2 000)、p-ERK5抗体(1∶2 000)、p-STAT3抗体(1∶2 000)4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，10 min/次，加辣根过氧化物酶标记的对应种属来源二抗(1∶5 000)，室温摇床孵育1 h后TBST漂洗3次，10 min/次，凝胶成像系统发光显色。

1.2.5ELISA检测IL-1β、TNF-α含量 收集LPS组和PBS组细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测细胞上清IL-1β、TNF-α含量。

2 结果

2.1炎症反应细胞模型的制备 LPS组IL-1β、TNF-α mRNA表达分别为426.41±18.38、5.26±0.30，显著高于PBS组(P<0.05)。LPS组细胞上清中IL-1β、TNF-α水平分别为(592.30±4.92)pg/ml、(433.70±14.62)pg/ml，显著高于PBS组(P<0.05)。

2.2lncRNA MIAT 在LPS刺激J774A.1细胞的核质表达 lncRNA MIAT在LPS组的相对表达量显著高于PBS组(P<0.05)，且主要表达于细胞核(图1)。

图1 lncRNA MIAT在LPS刺激的J774A.1细胞中的表达Fig.1 Expression of lncRNA MIAT in LPS stimulated J774A.1 cells

2.3lncRNA MIAT在J774A.1细胞的敲低效率及其对IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响 KD组IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量显著高于NC组(P<0.05)。见图2。

图2 敲低J774A.1细胞中lncRNA MIAT表达Fig.2 Knocking down of lncRNA MIAT in J774A.1

2.4lncRNA MIAT对转录因子的影响 与NC组相比，KD组p-ERK5蛋白表达显著提高 (P<0.05)；KD组p-NF-κB、p-STAT3、p-ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义(P=0.29)。见图3。

图3 lncRNA MIAT对转录因子磷酸化的作用Fig.3 Effect of lncRNA MIAT on transcription factors phosphorylation

2.5ERK5-IN-2对ERK5抑制效率及ERK5抑制后IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响 结果显示，与DMSO对照组比，抑制剂组p-EKR5蛋白水平显著降低(P<0.05)；IL-1β、TNF-α mRNA相对表达显著下降(P<0.05)。见图4。

图4 ERK5磷酸化对IL-1β、TNF-α mRNA表达的影响Fig.4 Effect of ERK5 phosphorylation on the expression of IL-1β and TNF-α mRNA.

3 讨论

尽管RA的病因及发病机制尚未明确，但随着研究不断深入，巨噬细胞在RA发病中的核心作用已得到广泛认可[2,11,12]。因此巨噬细胞炎症反应过程及机制的研究对揭示RA发病机制至关重要。lncRNAs是细胞因子等功能性蛋白的关键调节因素，在RA发病中的作用也被逐渐认可[13]。lncRNA MIAT被证实参与多种疾病的发生，可能与机体的炎症反应有关[14]。由于lncRNA MIAT在骨髓中高表达，以单核巨噬细胞炎症为主的骨髓水肿是RA早期的主要临床表现之一[8,10]。因而，课题组猜测lncRNA MIAT可能通过参与巨噬细胞炎症反应参与RA发病。本研究以小鼠巨噬细胞J774A.1为研究对象，探讨lncRNA MIAT是否参与巨噬细胞炎症反应及其可能参与的炎症通路。

研究发现，与PBS组相比，lncRNA MIAT在LPS组细胞显著高表达，提示lncRNA MIAT参与了炎症反应过程，与既往研究提出的lncRNA MIAT参与炎症反应的结论一致[9]。结果还证实lncRNA MIAT亚细胞定位主要位于细胞核，提示lncRNA MIAT主要发挥作用的部位可能在细胞核，但由于细胞质中lncRNA MIAT表达也相对增多，因此不能排除其可在细胞质发挥作用。为了进一步探索lncRNA MIAT对巨噬细胞炎症反应的影响，课题组利用shMIAT敲低J774A.1细胞中lncRNA MIAT的表达。结果显示炎症因子IL-1β、TNF-α mRNA表达上调，提示lncRNA MIAT在巨噬细胞中可能发挥抑制炎症的作用，为巨噬细胞炎症反应的深入研究提供了新的对象。

NF-κB、STAT3等相关转录因子介导的炎症通路是巨噬细胞炎症反应的主要途径[15]。NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3等多种转录因子磷酸化后入核，可在细胞核内影响炎症因子IL-1β、TNF-α转录[16-20]。lncRNAs可通过影响转录因子发挥调控作用[21]。因此推测，lncRNA MIAT可能通过影响与炎症通路相关转录因子发挥抑制炎症的作用。本研究分别对KD组及NC组J774A.1细胞的多种转录因子NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3进行检测，发现ERK5磷酸化水平在lncRNA MIAT的KD组显著高于NC组，提示lncRNA MIAT可能参与抑制ERK5磷酸化。此外，本研究发现在LPS刺激的J774A.1中加入ERK5特异性抑制剂ERK5-IN-2后，IL-1β、TNF-α mRNA表达明显减少，表明ERK5磷酸化可促进炎症因子的产生，与既往研究提出的ERK5可通过促进Toll样受体2激活增强IL-1β、TNF-α表达的结论一致[20]。综上所述，lncRNA MIAT可能通过抑制ERK5磷酸化通路减少IL-1β、TNF-α转录从而抑制巨噬细胞炎症反应，在巨噬细胞炎症反应中具有负向调控作用。

虽然lncRNA MIAT可能通过抑制ERK5磷酸化炎症通路来抑制巨噬细胞炎症反应，但在RA中lncRNA MIAT 与巨噬细胞炎症是否存在确切关系需要通过收集临床资料和动物实验进一步证明。机体发生炎症反应时，促炎因子大量释放堆积，抑炎因子作用发生弱化。lncRNA MIAT抑制炎症作用的发现，提示可以从促进抑炎基因表达的角度探索治疗以RA为代表的炎症疾病的新方向。