miR-21通过靶向TIMP3调控黑色素瘤细胞的免疫抑制

2020-09-29 07:21郭爱元付楚涵窦建华丁玉芳黄进华
中国免疫学杂志 2020年16期
关键词:黑色素瘤免疫治疗荧光素酶

陈 敏 郭爱元 付楚涵 窦建华 丁玉芳 黄进华

(中南大学湘雅医学院附属三医院皮肤科,长沙 410013)

黑色素瘤是一种由黑素细胞过度增生引起的皮肤肿瘤,多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜,是目前发病率增高最快的恶性肿瘤之一[1]。黑色素瘤形成及发展的过程存在免疫逃逸机制,肿瘤细胞通过分泌大量免疫抑制因子逃避机体自身免疫系统的监视和攻击,导致肿瘤转移[2,3]。黑色素瘤细胞的侵袭和远端转移往往导致患者预后较差。目前的治疗方式仍不能达到令人满意的效果,近期发现免疫治疗在多种实体瘤中取得较显著的疗效,因此免疫机制的研究对于黑色素瘤的免疫治疗具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在进化上高度保守的内源性小分子RNA,能够调控细胞增殖、分化、代谢和凋亡等生理病理过程[4]。近期研究发现miRNA在肿瘤的发生及发展中发挥重要作用。miR-21与黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤发生、发展、分期和预后密切相关[5-7]。研究显示miR-21可能是黑色素瘤潜在的治疗靶标,抑制其表达能够诱导黑色素瘤细胞发生凋亡[8]。金属蛋白酶组织抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)是各种癌细胞中的促凋亡蛋白,被鉴定为miR-21的靶基因[9]。目前有报道显示在乳腺癌荷瘤小鼠模型研究中,抑制肿瘤细胞中miR-21的表达,能够促进IL-10、IL-6、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等细胞因子的释放,调控免疫效应,抑制荷瘤鼠肿瘤的生长[10]。在黑色素瘤细胞中miR-21是否靶向调控TIMP3参与免疫反应的研究鲜有报道,因此本实验在细胞水平上验证miR-21和TIMP3的靶向调控作用,并对免疫抑制因子的影响进行初步分析,以期为黑色素瘤的免疫治疗提供实验及理论依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 22例皮肤恶性黑色素瘤组织及配对癌旁组织标本收集于中南大学湘雅医学院附属三医院2016年1月至2018年1月间病理科。22例黑色素瘤患者在切除手术后均经病理诊断确诊,患者术前均未行放疗、化疗及其他形式的抗肿瘤治疗。本研究经中南大学湘雅医学院附属三医院伦理委员会审核并批准,患者及家属均知情同意。所有标本收集后储存于液氮中。

1.1.2材料与试剂 黑色素瘤细胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2(美国ATCC);人正常表皮黑色素细胞株HeMa-Lp(上海斯信生物科技有限公司);DMEM培养基、M-254培养基(美国Invitrogen公司);胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司);青霉素、链霉素(杭州四季青生物工程材料有限公司);Lipofectamine 2000转染试剂(美国Thermo Scientific公司);Trizol试剂、反转录试剂盒(碧云天生物技术研究所);SYBR Green Master Mix检测试剂盒(日本TaKaRa公司);miR-21mimic、mimic control、miR-21 inhibitor、inhibitor control(上海吉玛制药技术有限公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京原平皓生物技术有限公司);引物及测序(上海生工生物工程股份有限公司);BCA蛋白定量检测试剂盒、ECL检测试剂盒(上海浩然生物技术有限公司);TIMP3抗体及二抗(美国Cell Signaling Technology公司);IL-10 ELISA检测试剂盒、TGF-β ELISA检测试剂盒、VEGF ELISA检测试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 黑色素瘤细胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2培养在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中,人正常表皮黑色素细胞株HeMa-Lp培养在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的M-254培养基中,均置于37℃、5% CO2培养箱中培养。根据细胞生长状态更换新鲜培养基,待细胞贴壁生长融合度达90%时以胰蛋白酶消化传代。

1.2.2qRT-PCR检测组织和细胞中miR-21的表达 采用Trizol试剂分别提取皮肤恶性黑色素瘤组织、配对癌旁组织标本中以及各细胞株中总RNA。经分光光度计检测RNA纯度和浓度后,按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以SYBR Green Master Mix荧光定量检测试剂盒扩增miR-21和内参。引物序列:U6引物:F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′,R:5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′。 miR-21引物:F:5′-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATT-TTTTG-3′,R:5′-AATTCAAAAAATAGCTTATCAG-3′。 20 μl反应体系,反应条件为:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40个循环,72℃延伸10 min。反应结束后统计每组Ct值,2-ΔΔCt法计算组织和细胞中miR-21相对表达水平。

1.2.3细胞转染 将培养的A375细胞系制备细胞悬液,并转移至24孔细胞培养板进行铺板,3.0×105个/孔。置于37℃培养箱中培养20 h,生长状态良好的细胞参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。以转染miR-21 mimic的细胞为miR-21组,以转染mimic control的细胞为miR-NC组,以转染miR-21 inhibitor的细胞为anti-miR-21组,以转染mimic control的细胞为anti-miR-NC组,以不做任何处理的细胞为Control组。转染后的各组细胞置于37℃培养箱中继续培养。细胞转染后24 h以qRT-PCR检测各组细胞中miR-21的表达水平,方法同1.2.2。收集细胞培养上清液用于检测IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.4ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量 收集各组细胞培养上清,分别按照IL-10、TGF-β、VEGF ELISA检测试剂盒说明书操作,采用双抗夹心ELISA法检测上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.5双荧光素酶报告基因实验 通过TagetScan生物信息学软件进行靶向结合位点预测,发现miR-21与TIMP3存在结合位点。将TIMP3 3′ UTR与miR-21结合序列扩增并连接到荧光素酶报告基因载体pmirGLO上;同时将TIMP3 3′ UTR与miR-21结合序列位点突变的序列连接到荧光素酶报告基因载体pmirGLO上。将构建好的载体送测并将鉴定正确的质粒与miR-21 mimic共转染至黑色素瘤A375细胞中,以转染mimic control为对照。转染24 h后收集各组细胞,以双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定Firefly荧光素酶活性和Renilla荧光素酶活性,统计每组相对荧光素酶活性。

1.2.6Western blot检测细胞中TIMP3蛋白表达水平 分别收集转染后24 h各组A375细胞及对照组细胞,加入蛋白裂解液置冰上裂解,提取各组细胞中总蛋白。经BCA蛋白定量检测试剂盒测定所提取蛋白浓度后,将蛋白质与上样缓冲液混合加热至蛋白变性,取50 μg变性蛋白以SDS-GAGE进行电泳分离蛋白,电泳结束后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,然后放置于含10%脱脂奶粉的封闭液中孵育4 h,取出后加入一抗(1∶1 000)4℃过夜进行杂交,取出后洗涤,加入二抗(1∶3 000),洗涤后以ECL化学发光,在成像系统中拍照,以β-actin为内参,采用Image Pro图像分析软件统计各条带灰度值,计算各组细胞中TIMP3蛋白表达水平。

1.3统计学分析 所得实验数据以统计学软件SPSS21.0分析,以单因素方差分析比较多组差异,以SNK-q检验比较组间差异,每组数据代表3个生物学重复,以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1miR-21在黑色素瘤组织和细胞中低表达 采用qRT-PCR检测黑色素瘤组织及对应癌旁组织中miR-21的表达水平,结果如图1A所示,与癌旁组织比,黑色素瘤组织中miR-21的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。检测不同黑色素瘤细胞株及正常表皮黑色素细胞株中miR-21的表达水平,结果如图1B所示,与正常表皮黑色素细胞相比,黑色素瘤细胞SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2中miR-21的表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。鉴于miR-21在不同黑色素瘤细胞株的表达水平,选择黑色素瘤细胞A375用于后续实验。

图1 不同组织和细胞中miR-21表达水平Fig.1 Expression levels of miRNA-21 in different tissues and cells

2.2转染miR-21 mimic对细胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影响 qRT-PCR检测结果显示,与miR-NC相比,miR-21组细胞中miR-21的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05,图2A)。ELISA检测结果显示,与miR-NC相比,miR-21组上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05,图2B~D)。

图2 转染miR-21 mimic对细胞中miR-21表达及上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量的影响Fig.2 Effects of miR-21 mimic transfection on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatant

2.3转染miR-21 inhibitor对细胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影响 qRT-PCR检测结果显示,与anti-miR-NC相比,anti-miR-21组细胞中miR-21的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05,图3A)。ELISA检测结果显示,与miR-NC相比,miR-21组上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05,图3B~D)。

图3 转染miR-21 inhibitor对细胞中miR-21的表达及上清中IL-10、TGF-β和VEGF的含量的影响Fig.3 Effects of miR-21 inhibitor transfections on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatants

2.4TIMP3是miR-21的靶基因 生物信息学软件TagetScan预测miR-21与TIMP3靶向结合位点,如图4A所示,miR-21能够与TIMP3 3′UTR靶向结合。双荧光素酶报告基因实验验证miR-21和TIMP3靶向结合关系,如图4B所示,与mimic control和TIMP3 3′UTR野生型共转染组相比,miR-21 mimic组和TIMP3 3′UTR野生型共转染组相对荧光素酶活性显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与mimic contro组和TIMP3 3′UTR突变型共转染组相比,miR-21 mimic组和TIMP3 3′UTR突变型共转染组相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。以上实验说明TIMP3是miR-21的靶基因。

图4 TIMP3和miR-21靶向结合关系验证Fig.4 Validation of target-binding relationship between TIMP3 and miR-21

2.5miR-21靶向调控TIMP3的表达 Western blot检测结果显示,与miR-NC相比,miR-21细胞中TIMP3蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,图5A)。与anti-miR-NC相比,anti-miR-21组细胞中TIMP3蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05,图5B)。

图5 转染miR-21 mimic及inhibitor后细胞中TIMP3蛋白表达水平Fig.5 Expression of TIMP3 protein in cells transfected with miR-21 mimic and inhibitor

3 讨论

黑色素瘤是皮肤常见恶性肿瘤,术后复发率高,且预后效果较差,死亡率较高。近年来免疫治疗在癌症治疗中取得了突飞猛进的进展,让越来越多的学者看到了免疫治疗的前景。免疫治疗在黑色素瘤的综合治疗中发挥重要作用,但肿瘤免疫逃逸大大影响了免疫治疗的效果[11]。因此对肿瘤免疫逃逸机制的研究在肿瘤免疫治疗中显得尤为重要。参与肿瘤免疫逃逸的免疫抑制分子包括IL-10、TGF-β1等,这些免疫抑制分子参与肿瘤细胞逃避免疫监视及细胞转型,为肿瘤细胞发生转移和增殖提供有利条件[12-14]。IL-10具有抑制巨噬细胞及自然杀伤细胞增殖的功能,在肿瘤免疫中发挥主要作用[15]。TGF-β1能够抑制T细胞的增殖、分化及活化,促进肿瘤细胞生长[16]。VEGF参与肿瘤血管发生及机体免疫调节过程,影响细胞毒性T细胞生物杀伤效应[17]。IL-10、TGF-β1和VEGF等细胞因子水平的增高能够抑制免疫反应,逃避免疫监视,促进肿瘤发展和转移[18]。因此通过对肿瘤的免疫逃逸机制的研究能够更清楚地了解肿瘤发生和发展的过程,可从提高机体免疫能力,逆转肿瘤免疫逃逸等多角度为黑色素瘤的免疫治疗提供新思路。

本实验通过检测黑色素瘤患者组织和不同黑色素瘤细胞株中miR-21的表达水平,发现miR-21在黑素色瘤组织和细胞中均呈低表达。通过在黑色素瘤A375细胞中转染miR-21 mimic,上调A375细胞中miR-21的表达,经ELISA检测发现IL-10、TGF-β1和VEGF的含量显著升高;下调A375细胞中miR-21的表达能够抑制细胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌。表明miR-21能够下调细胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的表达。与Chen等[19]关于丙型肝炎病毒感染上调miR-21的表达,靶向TLR信号通路的效应因子,参与逃避宿主免疫系统监视的研究相符。He等[20]的研究同样显示miR-21能够介导免疫应答,且能够影响小鼠移植瘤的生长。miR-21在免疫应答和炎症性疾病中起重要作用,且可通过抑制NF-κB信号通路促进淋巴细胞的增殖,在自身免疫性淋巴组织增生综合征中发挥重要作用[21-23]。此外本实验通过生物学软件预测及双荧光素酶报告基因实验验证了miR-21和TIMP3靶向结合关系,通过Western blot检测上调或下调miR-21的表达对A375细胞中TIMP3蛋白表达的影响,显示miR-21能够负向调控TIMP3的表达。与Nagao[24]和Gutsaeva等[25]miR-21能够靶向调控TIMP3的研究一致。综合以上实验,miR-21通过靶向抑制TIMP3表达影响细胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌参与黑色素瘤免疫逃逸。

总之,本研究发现miR-21靶向负调控TIMP3的表达调控黑色素瘤免疫逃逸,其作用机制可能与调控黑色素瘤细胞分泌的细胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的含量有关。下调细胞中miR-21的表达,提高相关免疫抑制分子的分泌,有效逆转肿瘤的免疫逃逸,为黑色素瘤的免疫治疗提供候选作用靶点。

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