白花蛇舌草提取物通过Hippo-YAP信号通路抑制胰腺癌SW1990细胞上皮细胞间质转化①

王自闯 张 娟 陈小永

(河南中医药大学第二临床医学院，郑州 450002)

胰腺癌属于恶性程度最高且预后最差的恶性肿瘤，目前临床主要采用手术并辅以放化疗等方法进行治疗，但常规化疗药物治疗效果不理想[1]。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性导致化疗失败，因而仍需寻找安全有效的治疗药物[2，3]。湿毒、热毒及湿热毒邪互结是诱发胰腺癌的主要原因，研究表明白花蛇舌草具有清热解毒与利水消肿等功效，并可抑制多种肿瘤细胞增殖[4]。另有研究显示细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)与肿瘤侵袭转移、耐药性等生物学过程密切相关[5]。关于白花蛇舌草提取物对胰腺癌细胞EMT的影响及作用机制的研究相对较少，因此本研究主要探讨白花蛇舌草提取物在胰腺癌中的生物学效应，初步分析其对Hippo-YAP信号通路的影响及与胰腺癌细胞EMT的关系，为临床合理用药提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞 人胰腺癌SW1990细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。

1.1.2主要试剂与仪器 白花蛇舌草购自本院中草药房，依据中国药典且经本院中医科验证；胰蛋白酶(批号170306)、胎牛血清(FBS)(批号170815)、RPMI1640培养基(批号170523)均购自美国BD公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(批号170205)购自碧云天生物有限公司；兔抗人Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)(批号170603)、磷酸化Yes相关蛋白(p-YAP)抗体(批号170701)均购自美国CST公司；CCK-8检测试剂盒(批号171003)均购自美国ThermoFisher公司；Hippo-YAP信号通路抑制剂XMU-MP-1(批号170920)购自美国MCE公司；兔抗E钙黏附蛋白(E-cadherin)(批号170711)、兔抗N-钙黏附蛋白(N-cadherin)(批号170612)、兔抗波形蛋白(Vimentin)(批号170621)、鼠抗α平滑肌动蛋白(α-SMA)(批号170615)、兔抗转录因子(Snail)(批号170618)单克隆抗体均购自美国Cell Signal公司；辣根过氧化物酶标记IgG抗体(批号170912)购自美国Santa Cruz公司；ECL发光蛋白(批号170810)购自上海锐赛生物技术有限公司；RIPA裂解液(批号170422)、BCA检测试剂盒(批号170418)、PVDF膜(批号170719)购自上海酶联生物科技有限公司。流式细胞仪购自美国BD公司；蛋白凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。冬凌草甲素(Oridonin，Ori)购自上海诗丹德生物技术有限公司，利用含有30%DMSO的灭菌水配制为5 mmol/L母液。

1.2方法

1.2.1细胞培养 胰腺癌SW1990细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，加入链霉素(100 μg/ml)、青霉素(100 U/ml)，置于培养箱中培养(37℃、5%CO2)，每2 d传代1次，稳定2～3代后，收集对数生长期细胞用于实验。

1.2.2试验处理与分组 白花蛇舌草研磨后过200目筛，选取50 g白花蛇舌草粉末，加入双蒸水煎煮3次，1 000 r/min离心15 min，待上清液浓缩至50 ml(1.0 g/ml白花蛇舌草提取物)，(MTT法，48 h检测细胞增殖抑制率)计算白花蛇舌草提取物的IC50值。根据IC50值将其终浓度分别稀释为20 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml白花蛇舌草提取物溶液备用。取对数期生长胰腺癌SW1990细胞，接种于培养板，继续培养24 h后进行处理，试验分为7组：①对照组：不添加任何药物处理；②低剂量组：加入20 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培养；③中剂量组：加入50 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培养；④高剂量组：加入100 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培养。4组细胞处理后均继续培养48 h。⑤抑制剂组：在SW1990细胞中加入Hippo-YAP信号通路抑制剂XMU-MP-1；⑥高剂量+抑制剂组：将抑制剂XMU-MP-1预处理SW1990细胞30 min后加入高剂量的白花蛇舌草提取物；⑦阳性对照组：在SW1990细胞中加入SW1990细胞EMT抑制剂Ori 15 μmol/L。收集各组细胞，检测各项指标。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖 待细胞融合度达80%左右，取对数生长期SW1990细胞，胰蛋白酶消化，制备单细胞悬浮液(5×104个/ml)接种于96孔板，继续培养24 h，分别在0、12、24、36、48、60、72 h加入CKK-8溶液(10 μl/孔)，避光培养2 h，收集细胞，应用全自动酶标仪检测各孔在450 nm波长处细胞吸光度，计算不同浓度白花蛇舌草提取物对SW1990细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-药物处理组吸光度均值/对照组吸光度均值)×100%。每个浓度设置4个复孔，实验重复3次。

1.2.4AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡情况 各组SW1990细胞分别处理48 h，胰酶消化(0.25%)分别收集各组SW1990细胞，PBS清洗，2 000 r/min 离心5 min，细胞密度调整为1×106个/ml，严格按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪检测SW1990细胞凋亡情况。每组设置4个复孔，实验重复3次。

1.2.5Western blot检测YAP、p-YAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达情况 PBS清洗各组细胞，加入RIPA裂解液，14 000 r/min离心15 min，收集上清，测定蛋白浓度。取50 μg蛋白，冰上冷却后8%聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白，采用全湿式电转膜法将目的蛋白移至PVDF膜，脱脂牛奶(5%)封闭1 h，分别加入YAP、p-YAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，ECL发光显影反应，目的蛋白均以β-actin为内参基因，并采用Bandscan图像分析系统检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

2 结果

2.1白花蛇舌草提取物IC50值 培养48 h后，本研究提取的白花蛇舌草提取物的IC50值为45.63 ng/ml，本研究选择50 ng/ml白花蛇舌草提取物作为安全实验剂量。见图1。

图1 白花蛇舌草提取物IC50值Fig.1 IC50 value of Hedyotis diffusa extract

2.2不同浓度白花蛇舌草提取物对SW1990细胞增殖的影响 与对照组相比，白花蛇舌草提取物不同剂量组SW1990细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)，且高剂量组显著高于中剂量组及低剂量组(P<0.05)，见图2。因此，本研究将以高剂量组进行后续试验。

图2 不同浓度白花蛇舌草提取物对SW1990细胞增殖的影响Fig.2 Effect of different concentrations of Hedyotis diffusa extracts Proliferation of SW1990 cells

2.3白花蛇舌草提取物对SW1990细胞凋亡的影响 与对照组相比，抑制剂组SW1990细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，而高剂量组、阳性对照组与高剂量+抑制剂组SW1990细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，且高剂量组和阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组(P<0.05)，见图3、表1。

表1 各组细胞凋亡率比较Tab.1 Comparison of apoptosis rate of cells of each group

图3 白花蛇舌草提取物对SW1990细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of Hedyotis diffusa extracts on apoptosis of SW1990 cells

2.4SW1990细胞中Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达情况 与对照组相比，抑制剂组SW1990细胞中YAP蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，而高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组均显著降低(P<0.05)，且高剂量组、阳性对照组显著低于高剂量+抑制剂组(P<0.05)；与对照组相比，抑制剂组SW1990细胞中p-YAP蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，而高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组均显著升高(P<0.05)，且高剂量组、阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组(P<0.05)，见图4、表2。

图4 细胞Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达情况Fig.4 Expression of protein related to Hippo Yap signaling pathway in cells

表2 细胞Hippo-YAP信号通路相关蛋白表达情况Tab.2 Expression of protein related to Hippo-Yap signaling pathway in cells

2.5SW1990细胞中EMT相关蛋白表达情况 与对照组相比，抑制剂组SW1990细胞中E-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达量均显著升高(P<0.05)；高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组SW1990细胞中E-cadherin蛋白表达量显著升高(P<0.05)，且高剂量组、阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，且高剂量组、阳性对照组显著低于高剂量+抑制剂组(P<0.05)，详见图5、表3。

表3 各组SW1990细胞中EMT相关蛋白表达情况Tab.3 Expression of EMT related proteins in SW1990 cells of each group

图5 各组SW1990细胞中EMT相关蛋白表达情况Fig.5 Expression of EMT related proteins in SW1990 cells of each group

3 讨论

胰腺癌是一种起源于腺管上皮的导管腺癌，其早期临床症状不明显，绝大部分患者就诊时已处于临床晚期，且术后患者生存率极低[6]。研究表明胰腺癌发生过程涉及多个基因表达异常，但关于胰腺癌发病机制尚未完全阐明[7]。目前关于白花蛇舌草提取物与胰腺癌细胞EMT的相关研究相对较少，因此本研究旨在分析白花蛇舌草提取物对胰腺癌细胞EMT的作用及通过激活Hippo信号通路的可能机制。

白花蛇舌草可通过p38与ERK1/2 MAPK途径并抑制基质金属蛋白酶-9和细胞间黏附分子-1表达抑制转移潜能进而诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡[8]。白花蛇舌草提取物还可通过调控相关因子表达进而抑制结直肠癌、肝细胞癌增殖及迁移[9-11]。研究表明白花蛇舌草提取物可通过降低Notch信号通路相关蛋白表达进而抑制肝癌发生及发展[12]。本研究结果显示白花蛇舌草提取物不同剂量组SW1990细胞增殖抑制率显著高于对照组，且高剂量组显著高于中剂量组、低剂量组，说明白花蛇舌草提取物可有效抑制胰腺癌细胞增殖，且呈剂量依赖效应。Hippo信号通路可有效抑制细胞生长，并可参与细胞增殖、凋亡等生物学过程，其核心组分包括MST1/2、LATS1/2、YAP、SAV1、MOB1，其中YAP是致癌基因而信号通路中其他几个基因均为抑癌基因[13]。研究表明Hippo信号通路激活后下游效应因子YAP发生磷酸化反应，而p-YAP滞留于细胞质内并发生降解，进而不可进入细胞核发挥转录激活功能，Hippo信号通路抑制后，YAP可进入细胞核，其通过与TEADs等多种转录因子相互作用并调控下游基因表达进而促进肿瘤增殖、迁移及侵袭[14]。已有研究显示，Ori可抑制SW1990细胞发生EMT，抑制细胞增殖、迁移与侵袭[15]。本研究以其为阳性对照，通过抑制Hippo信号通路分析其与白花蛇舌草提取物对胰腺癌细胞的作用，结果显示抑制剂组SW1990细胞凋亡率显著低于对照组，而高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组显著升高，且高剂量组、阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组，与文献报道相似[16]。提示白花蛇舌草提取物可促使胰腺癌细胞凋亡。同时本研究分析Hippo信号通路相关蛋白表达，结果显示抑制剂组SW1990细胞中YAP蛋白相对表达量显著高于对照组，而高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组均显著降低，且高剂量组和阳性对照组显著低于高剂量+抑制剂组；而抑制剂组SW1990细胞中p-YAP蛋白表达量显著降低，高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组均显著升高，且高剂量组、阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组，高剂量组、阳性对照组无显著差异，说明白花蛇舌草提取物处理后胰腺癌细胞中p-YAP蛋白表达升高，提示白花蛇舌草提取物可抑制胰腺癌SW1990细胞增殖并促进其凋亡，其可能通过激活Hippo-YAP信号通路发挥作用。

EMT表型转换主要是上皮细胞向间质细胞转变导致其转移及侵袭能力增加，若上皮分子标记如E-cadherin表达下调而间质分子标记如N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail等表达上调即为促进EMT过程，反之则为抑制EMT发生[17]。研究表明EMT可促进胰腺癌细胞迁移及侵袭，通过抑制肿瘤细胞EMT可抑制其增殖及迁移并促使其凋亡[18，19]。相关研究显示Hippo-YAP信号通路被抑制后，YAP表达水平上调并可促进EMT过程进而抑制肿瘤细胞凋亡[20]。本研究结果显示抑制剂组SW1990细胞中E-cadherin表达量显著低于对照组，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail表达量均显著升高；高剂量组、阳性对照组及高剂量+抑制剂组E-cadherin蛋白表达量显著升高，且高剂量组和阳性对照组显著高于高剂量+抑制剂组，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表达量均显著降低，且高剂量组和阳性对照组显著低于高剂量+抑制剂组，说明抑制Hippo-YAP信号通路可促进胰腺癌SW1990细胞发生EMT，白花蛇舌草提取物处理后可抑制胰腺癌SW1990细胞EMT的发生，其可能与Hippo-YAP信号通路激活有关。提示白花蛇舌草提取物可能通过激活Hippo-YAP信号通路进而抑制胰腺癌SW1990细胞EMT。

综上所述，白花蛇舌草提取物可抑制胰腺癌SW1990细胞EMT，其可能通过Hippo-YAP信号通路实现，为临床白花蛇舌草提取物治疗胰腺癌的分子机制提供理论依据。本研究存在一定不足，关于白花蛇舌草提取物治疗胰腺癌过程中其他相关信号通路及其可能作用机制有待深入研究。