IL-6磁微粒化学发光定量检测方法的建立和评价

刘 珂 李双法 李 奎 于 林 程云龙

(郑州安图生物工程股份有限公司，郑州 450016)

IL-6是机体细胞因子网络中的重要成员，属于先天性免疫系统细胞因子，主要由淋巴细胞产生，在机体各组织普遍表达，在健康人血清中的含量极低[1]。IL-6最早于1980年被发现，分子量为22～27 kD，其前体肽有212个氨基酸，其中1～28位氨基酸是其前导肽，成熟肽由184个氨基酸组成[2]。作为当前所发现的功能最广泛的细胞因子之一，IL-6生物效能复杂，能够作用于多种效应细胞，在机体的造血调控和免疫应答等方面发挥重要作用。IL-6 的失调可能导致许多疾病的发生，例如肿瘤、慢性炎症(如类风湿关节炎)、脓毒症等，其临床表现为发病时 IL-6 水平增高[3]。另外，手术患者的IL-6浓度可以预示手术并发症产生的可能[4，5]；连续监测重症监护患者IL-6的水平能够有效评估系统性炎症反应综合征的严重程度，脓毒血症以及脓毒血症性休克的预后情况[6，7]；IL-6还能作为脓毒血症的早期警告指标[8，9]。目前，IL-6检测已在临床实验室广泛开展，其检测方法主要有生物学检测方法和免疫学检测方法。免疫学方法检测作为临床常用的检测方法，已有相关商品化试剂盒供应，如电化学或化学发光法 IL-6 免疫分析试剂盒等。但是目前医院所用大多为进口试剂盒，仪器、试剂和耗材价格昂贵，仪器维护成本高。随着国内全自动磁微粒化学发光技术的提高及国产试剂盒质量的改善，自主开发IL-6检测试剂盒十分必要。在市场上占有率最高的罗氏公司IL-6试剂盒采用电化学发光原理，三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下发生氧化还原反应发出可见光，其相对光强度RLU与待测IL-6抗原浓度成正比。本研究利用国产全自动化学发光免疫分析仪，采用辣根过氧化酶(HRP)标记在IL-6抗体上，固相抗体、IL-6抗原与HRP标记的抗体在发光底物鲁米喏的作用下，持续发出可见光，RLU与待测IL-6抗原浓度也成正比例关系，在此原理下基于CLIA建立IL-6水平检测方法，对其进行条件优化及性能评估。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1血清标本 收集2019年1～7月于郑州市中心医院就诊的发热、肺炎等患者血清300例；正常人标本200例取自体检科。

1.1.2试剂与仪器 郑州安图生物工程股份有限公司生产的全自动化学发光测定仪 AutoLumo A2000 plus；罗氏 e601及配套IL-6电化学发光检测试剂盒；抗IL-6小鼠单克隆抗体(郑州伊美诺生物技术有限公司)；IL-6国际标准品(英国国家生物标准与检定，NIBSC，89/548)。

1.2方法

1.2.1包被抗体的制备 取磁珠包被缓冲液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反复吹打，置于磁珠分离器上吸取上清后，添加碳二亚胺活化液，室温反应30～60 min，然后加入鼠抗人IL-6捕获抗体偶联2 h或过夜，偶联结束后，置于磁珠分离器上吸取上清，加入乙醇胺溶液进行封闭30 min，吸取上清后加入封闭液，混匀后置于磁珠分离器，弃上清，重复3～5次后，加入封闭液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.2.2辣根过氧化物酶标记IL-6抗体的制备 采用过碘酸钠法标记IL-6抗体并用半饱和硫酸铵法纯化并透析，取上清加入50%甘油于-20℃保存。

1.2.3条件优化 包被磁珠保护液缓冲、包被抗体浓度、酶标记抗体浓度等条件均需优化，本文采用高值和低值混合血清标本来优化以上条件。

1.2.3.1共比较3种缓冲体系： ① 0.02 mol/L PBS(pH7.2)；② 0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.2)；③ 0.05 mol/L MES(pH5.5)，以检测信号值和与罗氏浓度相关性为主要考核目标。

1.2.3.2考核包被抗体浓度 以信号值为主要标准，选择三个梯度：10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，比较其高中低值标本的信号值大小。

1.2.3.3选择最优酶标记抗体浓度 设置不同的梯度：0.6 μg/ml、0.4 μg/ml、0.2 μg/ml、0.1 μg/ml、0.05 μg/ml，考核其信号值大小。

1.2.4IL-6标准品配制 将 IL-6国际标准品用体系缓冲液(0.01 mol/l PBS、10 g/l BSA) 稀释配制成不同浓度的校准品溶液S0～S5，浓度分别是0、5、50、200、500、1 000 pg/ml，分装保存于-20℃。

1.2.5分析性能评估

1.2.5.1灵敏度 按照 CLSI EP17-A 文件[10]进行灵敏度的考核。准备5份接近0值的临床标本，每个标本重复3次，连续检测4 d；准备5份浓度范围在LoB的1～4倍之间的标本，每天各检测4次，间隔不小于2 h，每个指标2个重复，共进行5 d；按照EP17-A2的方法进行结果分析，计算LoB、LoD、FS。

1.2.5.2精密度 检测高、中、低值混合均匀的IL-6水平血清标本，不同浓度标本每天各检测2次，每次2个重复，间隔不小于2 h，连续测定20 d，分别计算各标本分析内精密度、分析间精密度及总不精密度。

1.2.5.3线性范围 根据EP06-A文件进行线性范围的建立。具体方法如下：准备10份浓度约为1 300 pg/ml的临床高值标本和1份浓度接近于0的临床低值标本，按照不同比例混合，制备出10组系列浓度的标本，作为线性标本进行测定，计算线性范围。

1.2.5.4最大稀释倍数 选择线性范围内的高值血清，用校准品稀释液按2、4、8、16、32倍比稀释，每个稀释倍数连续测定3次，取其平均值作为实验的测定结果，计算偏差。偏差=(实测值-预测值)/预测值×100%。

1.2.5.5准确度 根据EP09文件进行试剂盒的回收率评估。具体方法如下：选择高值标本10份，按照1∶9的比例分别加入到10份低值标本/基质标本中，制成回收标本，每个回收标本重复检测3次求均值，计算回收率。回收率r=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% (V0：低值标本的体积，VS：高值标本的体积，C：回收标本的检测浓度，C0：低值标本的检测浓度，CS：高值标本的检测浓度)。

1.2.5.6干扰实验 取 IL-6浓度高、低值血清待测标本，分别加入不同浓度的血红蛋白、三酰甘油、 胆红素作为干扰标本，同时添加相同体积的体系缓冲液作为基础标本，用本方法测定浓度值。计算干扰率。干扰率=(分析样品的测定浓度-基础样品的测定浓度)/基础样品的测定浓度×100%。

1.2.5.7方法学比对 根据EP09-A2文件，分别用本文方法和罗氏检测系统平行检测。

1.3统计学处理 线性拟合采用Excel软件进行，性能评价按照EP文件的实验要求，实验结果采用SPSS20.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1条件优化

2.1.1包被磁珠保护液缓冲条件 本研究中，磁珠包被结束后保护液的选择至关重要，图1A表明，使用0.02 mol/L PBS作为保护缓冲液时，检测信号值达到最大，且相关性也较好，故体系缓冲液采用0.02 mol/L PBS。

图1 IL-6磁微粒化学发光检测试剂条件优化Fig.1 Optimization of conditions for IL-6 magnetic particle chemiluminescence reagent

2.1.2包被抗体浓度 由图1B可知，随包被抗体浓度增加，发光信号值并没有明显升高，说明当包被抗体浓度为10 μg/ml已达到饱和状态，故将包被抗体浓度定为10 μg/ml。

2.1.3酶标记抗体浓度 随标记抗体浓度的增大，信号值逐渐升高，但阴性值区信号值也增大，导致阳性和阴性浓度比值(P/N)减小，低值标本区分度较差。综合考虑信号值和本底问题，选择酶标记抗体浓度0.2 μg/ml为最佳标记抗体浓度，见表1。

表1 IL-6酶标记抗体浓度检测结果Tab.1 Results of labeled antibody concentrations

2.2标准曲线 依次配制不同浓度的国际标准品(1 000、500、200、50、5、0 pg/ml)，采用每个浓度重复检测3次，得到一组对应的IL-6浓度与发光信号强度值。建立四参数拟合数学模型，以浓度的lg值为X，以光信号强度的lg值为Y，函数方程为Y=(8.270 65-3.725 51)/[1+(X/35.563 55)^(-0.489 29)]+3.725 51，R2=0.999，见图2。

图2 IL-6磁微粒化学发光检测试剂标准曲线Fig.2 Standard curve of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3分析性能评估

2.3.1灵敏度 按照CLSI EP17-A文件，对灵敏度的测试结果进行分析和计算，得到LoB、LoD、FS各为0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml。

2.3.2精密性 对高、中、低值三个标本分别80个数据进行分析，结果显示，分析内精密度、分析间精密度均小于10%，总不精密度小于15%，见表2。

表2 IL-6磁微粒化学发光检测试剂精密度检测结果Tab.2 Precision of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.3线性范围 10组线性标本回归方程的相关系数R2均大于0.990，且每个标本的实际测得浓度与理论浓度的相对偏差均小于10%，以一组标本为例，具体数据见表3。因此本研究建立的IL-6检测方法的线性范围为3～1 000 pg/ml。

表3 IL-6磁微粒化学发光检测试剂线性范围检测结果Tab.3 Linear range of IL-6 magnetic particle chemilum-inescence assay

2.3.4最大稀释倍数 由表4可得，此方法中稀释倍数为8，10个标本的偏差均 ≤ 15%，故此方法的最大稀释倍数为8倍。

表4 IL-6磁微粒化学发光检测试剂最大稀释倍数检测结果Tab.4 Maximum dilution factor of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.5准确度 选择线性范围内的高值血清，用接近0值的阴性血清按1∶9的比例稀释，制成回收标本，回收率在(100±15)%为符合需要。由表5可知，实验中的10个标本的回收率均在误差范围内，故此方法的回收率满足要求。

表5 IL-6磁微粒化学发光检测试剂回收率检测结果Tab.5 Recovery rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.6干扰实验 准备IL-6浓度高、低值血清待测标本，分别将不同浓度的血红蛋白、三酰甘油、 胆红素加入2份待测标本中作为干扰标本，同时以添加相同体积的体系缓冲液作为基础标本，来得到干扰率，由表6可知，血红蛋白、三酰甘油、胆红素浓度分别≤200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl时，干扰率≤15%IL-6的检测结果无显著影响。

表6 IL-6磁微粒化学发光检测试剂干扰实验检测结果Tab.6 Interference rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.7方法学比对 根据EP09-A2文件，采用安图和罗氏操作系统，分别测定100份临床血清，以罗氏IL-6检测结果为X轴，以基于本方法的安图IL-6检测结果为Y轴，如图3所示，线性回归方程为：Y=0.955 X+9.263，R2=0.993 2。

图3 两种系统测试结果相关性拟合曲线Fig.3 Correlation curve of test results of two system

3 讨论

IL-6是一种功能广泛的细胞因子，也是一种重要的炎症因子，在发生内外伤、外科手术、感染、脑死亡及其他情况的急性炎症反应过程中，IL-6会快速生成，同时IL-6在慢性炎症反应(如类风湿关节炎)中也扮演重要角色[11，12]。能够准确快速地定量检测体内血清或血浆中IL-6水平，对炎症、感染性疾病等患者具有重要的临床指导意义。本研究采用双抗体夹心法，基于安图磁微粒发光系统，建立了IL-6磁微粒化学发光定量检测法。

本文介绍的IL-6检测方法，其LoB、LoD、FS分别为0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml；且精密度良好，分析内变异≤7%，分析间变异≤10%，总不精密度≤12%；线性范围3～1 000 pg/ml，若有超限标本，最大稀释倍数为8倍，即将超限标本与稀释液最大按1∶7稀释可计算其具体浓度；其回收率在(100±15)%以内，符合要求；另外，标本中的血红蛋白、三酰甘油、胆红素浓度分别为200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl时，其检测结果基本不受影响。且利用本检测系统与试剂与罗氏检测系统与试剂平行检测100份血清标本，结果显示二者有较高的拟合性，其斜率为0.955，相关性R2≥ 0.99。

本研究建立的IL-6定量检测的方法具有快速、高通量、高灵敏度、高精密度和高特异性等优点，可满足临床IL-6定量分析的需要，为术后患者恢复过程的监测及炎症甚至脓毒症的早期临床预警诊断提供帮助，如反映炎症活动情况及疾病严重程度，且与进口试剂相比价格相对低廉，性价比高，能够缓解患者的经济负担，有较大的临床使用价值。