时差成像系统对囊胚培养及妊娠结局的影响

高洋，刘军霞，朱家红，韩伟，黄国宁

(重庆市妇幼保健院遗传与生殖研究所，重庆 400013)

随着人类辅助生殖技术(ART)不断发展，囊胚培养的应用更加广泛。移植囊胚阶段的胚胎与卵裂期胚胎相比，可以提高胚胎与子宫内膜容受的同步性，增加对胚胎的体外筛选并获得更好的妊娠率和着床率[1-4]。但囊胚培养延长了胚胎在体外的培养和暴露时间，因此，对实验室的体外培养体系有更高要求，优良的体外培养条件是促进囊胚形成的重要因素之一[5-6]。

时差成像系统(time-lapse imaging，TLI)是近年来发展的一种新的无创胚胎培养与评估体系，能实时观察从胚胎受精开始到其移植的连续动态分裂图像。并且与传统培养体系相比，TLI能够避免胚胎被多次移出培养箱观察，为胚胎发育提供了更稳定的温度、湿度、PH值及气体含量等培养条件。研究表明TLI能为胚胎培养提供安全稳定的培养环境，更好地预测胚胎的发育潜能并改善卵裂期胚胎的妊娠结局[7-10]。TLI的这些优势为囊胚培养提供了新的思路，本研究通过比较TLI与常规培养系统的囊胚培养效果及囊胚移植后的妊娠结局，旨在提高囊胚形成率、优化囊胚培养方案。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2018年12月在本中心接受ART治疗并行囊胚培养的不孕患者的临床资料。

纳入标准：女方年龄<40岁；单纯输卵管因素不育；第1次行囊胚培养并在获得可利用囊胚后行全囊胚冷冻，待内膜准备后移植冻融囊胚的患者。排除标准：排除子宫及宫腔病变、男方精液异常、夫妻双方患染色体疾病的患者。所有患者均自愿进行囊胚培养并签署了囊胚培养知情同意书。

本研究共纳入481例不孕患者(481个周期)，根据囊胚培养方式不同分为采用TLI系统进行囊胚培养的TLI组(n=189)和采用传统培养体系培养囊胚的标准培养系统(SI)组(n=292)。

二、研究方法

1.促排卵、取卵、受精：所有患者均采用我中心的标准长方案[11]进行促排卵，当至少3个主导卵泡直径达到18 mm时，于当晚注射HCG(Ovidrel，Merck Serono，意大利)5 000～10 000 U，36～38 h后在阴道超声引导下行穿刺取卵。获得的卵冠丘复合物在2.5 ml G-IVF培养液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)中培养至受精。对所有患者行常规IVF，即HCG注射后39～40 h将卵母细胞加入约含10 000～15 000条精子的精子滴内共同培养，18 h后去除卵母细胞外颗粒细胞，显微镜下观察出现两个原核视为正常受精。

2.囊胚培养及评分：(1)TLI培养系统：将正常受精的合子转入含G-1培养液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)的TLI专用培养皿(EmbryoSlideTM，Unisense Fetilitech，丹麦)中，放置于TLI(EmbryoScopeTM，Unisense Fertilitech，丹麦)培养系统中培养至受精后66～68 h(D3)，暂停图像，取出培养皿，将G-1培养液吸尽换成囊胚G-2培养液(Vitrolife Sweden AB，瑞典)，再次放入TLI系统中培养至113～139 h(D5～D6)。TLI系统每5 min记录1次胚胎图像并生成动态胚胎发育视频，根据视频图像结合Peter卵裂期胚胎评分系统[12]和Gardner囊胚评分系统[13]进行胚胎评分和选择。将D3发育至4～10个卵裂球，评级为Ⅰ～Ⅲ级的胚胎定义为可利用胚胎，评级标准如下：Ⅰ级：卵裂球大小均匀、形状规则、胞质均匀、无颗粒现象、碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球大小稍不均匀、形状稍不规则、胞质有少量颗粒、碎片10%～20%；Ⅲ级：卵裂球不均匀、形状不规则、胞质有明显颗粒现象、碎片20%～50%；Ⅳ级：卵裂球严重不均匀、形状严重不规则、胞质有严重颗粒、碎片>50%。囊胚评级根据囊腔扩张程度分为1期(囊胚腔小于囊胚体积的50%)、2期(囊胚腔超过囊胚体积的50%)、3期(囊胚腔充满整个囊胚)、4期(囊胚扩张、体积变大并透明带变薄)、5期(囊胚部分从透明带孵出)和6期(囊胚完全孵出)。对3～6期的囊胚再根据内细胞团和滋养层细胞进行评级：内细胞团A级为细胞数量多且分布紧密，B级为细胞数量较少且松散，C级为细胞数量极少；滋养层A级为细胞较多且连接紧密，B级为细胞少且连接松散，C级为细胞极少。(2)SI培养系统：将正常受精的合子转入含G-1培养液的Nunclon细胞培养皿(NunclonTM，Nunc，丹麦)中，放置于常规培养箱(SANYO，MCO-5M，日本)中进行培养，并于受精后44～46 h(D2)、66～68 h(D3)分别取出，在显微镜下观察并记录胚胎评分情况，将D3可利用胚胎(4细胞Ⅲ级以上胚胎)转入囊胚G-2培养液中，再次放入常规培养箱中培养至受精后113～115 h(D5)及137～139 h(D6)观察囊胚形成情况。参照Gardner囊胚评分标准，将D5或D6评级高于3CC的囊胚定义为可利用囊胚。囊胚扩张程度达到或高于3期(即3、4、5、6期)，内细胞团和滋养层细胞达到BB级及以上(包括AA、AB、BA、BB)的囊胚视为优质囊胚。

3.囊胚冷冻、复苏与移植：对所有可利用囊胚行激光打孔人工皱缩后，采用商品化冷冻与复苏液(Kita，Toyota，日本)按照试剂盒提供方法进行囊胚冷冻与复苏。患者在囊胚冷冻3个月经周期后采用人工周期的方法准备内膜，当内膜厚度达到7 mm以上时加用孕激素(Crinone，Merck Serono，丹麦)转化子宫内膜，并于第5天选择复苏囊胚1～2枚。两组患者均按D5优质囊胚、D6优质囊胚、D5可利用囊胚、D6可利用囊胚的顺序选择复苏囊胚。TLI组在此顺序基础上再结合动态图像优先选择复苏细胞期阶段不存在直接卵裂模式的优质或可利用囊胚，即D5优质囊胚如出现直接卵裂则选择复苏D6优质囊胚，依此类推。直接卵裂模式包括1细胞直接卵裂至3细胞(1至3细胞卵裂)和2细胞直接卵裂至5细胞(2至5细胞卵裂)(图1)。复苏囊胚转入G-2培养液中培养2～4 h等待移植，移植前观察囊胚完全扩张或未扩张但50%以上细胞存活即可在腹部B超引导下行囊胚移植。

A：1细胞直接卵裂至3细胞；B：2细胞直接卵裂至5细胞图1 直接卵裂模式示意图

4.观察指标：主要观察指标为囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率、临床妊娠率、着床率和流产率。囊胚形成率=囊胚形成数/培养囊胚数×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚数/培养囊胚数×100%；优质囊胚率=优质囊胚数/培养囊胚数×100%；临床妊娠率=临床妊娠患者数/移植周期数×100%；着床率=孕囊数/总移植胚胎数×100%；流产率=早期自然流产患者数/临床妊娠患者数×100%。临床妊娠率和着床率是以胚胎移植后5周通过超声检查探及宫内孕囊为标准。早期自然流产是指临床妊娠12周之前的妊娠丢失。

三、统计学分析

结 果

一、两组患者的一般资料比较

两组患者的年龄、体重指数(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)水平、不孕年限、Gn总量、获卵数及转化日内膜厚度比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的一般资料比较(-±s)

二、两组患者的囊胚培养结局比较

两组患者的受精率、2PN卵裂率和D3可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者囊胚培养结局比较(%)

三、TLI组胚胎直接卵裂结果

TLI组形成的可利用囊胚中有39枚来源于1细胞直接卵裂为3细胞的胚胎，有20枚来源于2细胞直接卵裂至5细胞的胚胎，分别占可利用囊胚的比率为4.11%(39/949)和2.11%(20/949)。共有3例患者移植的囊胚中含有直接卵裂来源的胚胎：其中1例患者仅获1枚可利用囊胚并来源于1细胞直接卵裂为3细胞的胚胎，移植后未妊娠；另2例患者均获2枚囊胚，其移植的2枚囊胚中分别含有1枚1细胞直接卵裂为3细胞的胚胎和1枚2细胞直接卵裂为5细胞的胚胎，均获得1个着床孕囊。

四、两组患者移植囊胚质量比较

截至2019年12月31日，共有360例患者入院接受复苏囊胚移植，其中TLI组143例，SI组217例。两组间移植囊胚数、移植优质囊胚率、移植D5及D6囊胚率比较均无显著性差异(P>0.05)；两组中移植D5囊胚率均显著高于同组移植D6囊胚率(P<0.05)(表3)。

表3 两组患者移植囊胚质量比较[(-±s)，%]

五、两组患者临床结局比较

TLI组移植后的临床妊娠率和着床率均显著高于SI组(P<0.05)；两组患者的流产率比较无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 两组患者妊娠结局比较(%)

讨 论

TLI作为新的胚胎培养与评分系统，因其稳定可控，并能够提供胚胎动力学参数的优势明显，已越来越广泛地应用在卵裂期胚胎的培养与选择中。目前已有较多文献报道采用TLI进行卵裂期胚胎培养的效果及妊娠结局优于传统培养箱[9，14-16]，也有研究表明TLI得出的卵裂期胚胎动力学参数能够预测囊胚的形成率及囊胚质量[17-18]，而TLI直接应用于囊胚培养效果的评价甚少。本研究比较了采用TLI与SI行囊胚培养的效果，结果显示两者的囊胚形成效果相似，但移植TLI培养形成囊胚的临床妊娠率和着床率均显著高于传统培养系统。Pribenszky等[14]通过meta分析，提出移植TLI系统培养的胚胎能够获得更高的临床妊娠率和更低的流产率。Alhelou等[10]研究发现与TLI培养系统相比，普通培养箱中培养的胚胎早期发育未受影响，但从D3开始的后期发育受不稳定培养条件的影响逐渐显现，结果显示TLI中培养的囊胚移植后着床率更高。

TLI可以避免胚胎被移出观察时多次开关培养箱造成的培养环境改变，能为胚胎发育提供更稳定的外环境，为卵裂期胚胎的培养提供了更好的选择。但因为本研究中将胚胎培养至囊胚期采用的是序贯培养基，因此需在第3日将胚胎移出换液，无法使囊胚在整个过程中培养环境保持恒定。另一方面TLI的安全性亦存在争议，为了获得连续的胚胎发育图像，TLI中图像采集系统会定时对胚胎进行拍照，这种周期性光源照射可能会对胚胎发育产生危害[19]。但是已有研究报道采用TLI培养并移植的胚胎能够获得健康活产婴儿[15，20]，提示TLI可能并不影响胚胎发育，但其观察系统的安全性仍有待进一步评估。这些影响因素可能是本研究结果中TLI组囊胚形成率、可利用囊胚率及优质囊胚率未显著高于SI组的原因。

本研究中两组患者均根据Gardner囊胚评分系统对囊胚进行形态学上的评分和选择，TLI组中由于提供了胚胎动态发育图像，使我们能够获得更多参考指标，包括各种时间参数和卵裂模式。目前国内外针对这些动态参数运用于胚胎选择的研究甚多，但哪些指标效果最佳仍无定论。近期，胚胎异常卵裂模式中的直接卵裂受到了很多关注。一些研究表明，由直接卵裂发育而来的胚胎发育潜能低下、种植率和出生率降低、流产率增高，但此种类型的胚胎可能在形态学上并未表现出明显异常，亦可发育成为可利用囊胚，因此通过传统培养方式的胚胎观察无法进行识别和筛选[21-23]。本研究中为了提高工作效率、优化胚胎选择流程，TLI组在胚胎选择时采用形态学评分结合细胞期阶段无直接卵裂模式的参考指标筛选囊胚。有文献报道胚胎卵裂模式异常的原因可能是多倍体和遗传紊乱，采用TLI动态指标联合形态学评估筛选胚胎可以降低非整倍体风险，继而提高胚胎着床潜能[24-25]。目前，胚胎发生直接卵裂的原因尚不清楚，有研究分析认为异常增多的中心粒可能引起纺锤体形成三极结构，造成卵裂球在有丝分裂过程中染色质异常分离而直接分裂成3细胞[22-23，25]。另外，直接卵裂细胞也可能存在染色体整合不完全、微核形成或多核的核缺陷[22]。本研究中TLI组在囊胚移植时采用形态学评分结合动态发育指标的方法选择胚胎，结果获得了明显升高的妊娠率和着床率，这与Meseguer等[9]和Rubio等[26]研究报道的结果一致。

囊胚培养可以有效剔除卵裂期至囊胚期发育过程中潜能差或部分染色体异常的胚胎，并且囊胚期胚胎移植与子宫内膜同步性更佳，因此囊胚移植的妊娠结局更好，但囊胚着床的影响因素仍较多。为了降低研究偏倚，本研究均纳入冻融囊胚移植的患者，且通过人工周期准备内膜减少了鲜胚周期卵巢刺激、血清激素水平[27]及内膜因素等的干扰。

综上所述，目前并无确切证据表明采用TLI行囊胚培养的效果优于传统培养系统，本研究中由于采用了序贯培养基而影响了TLI系统中囊胚发育环境的稳定性，今后可以尝试换用一步法的单一培养基进行操作，以进一步证实TLI是否有利于囊胚的形成。本研究结果中TLI培养的囊胚移植妊娠结局更佳，可能与TLI系统联合了传统形态学与TLI动态指标对囊胚进行筛选有关。另一方面虽然TLI可以实时拍摄并存储胚胎发育图像，但由此产生的数据指标很多，且大部分软件需要手动标记、分析动态指标，繁琐的工作量限制了TLI动力学参数的广泛运用，采用TLI行囊胚培养联合人工智能分析图像选择胚胎将是我们将来的研究方向。