全胚冷冻周期胚胎复苏后空泡对妊娠结局的影响

朱家红，武丽红，熊顺，高洋，黄国宁

(人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆市遗传与生殖研究所，重庆市妇幼保健院，重庆 400013)

冻融胚胎移植(FET)是辅助生殖技术(ART)中冷冻保存胚胎、解冻复苏后再移植回子宫的一种技术。FET周期相对于控制性卵巢刺激(COS)鲜胚移植周期，子宫内膜发育和内膜准备控制得更精细，可形成更好的内膜容受性[1]，改善种植结局。目前大部分患者由于囊胚培养的不确定性，仍选择全部卵裂期胚胎冷冻或冻存部分卵裂期优质胚胎，剩余胚胎则继续进行囊胚培养。随着全胚冷冻周期率越来越高，FET后的妊娠结局也备受关注。胞质空泡形成是胚胎体外培养过程中胞质异常的常见现象，可见于植入前胚胎发育的各个阶段以及冷冻解冻后的胚胎。本单位之前文献报道COS周期鲜胚移植中有空泡现象的胚胎表现出与种植率和妊娠结局无显著相关性的特点[2]，我们将空泡作为其中一个因素参与胚胎评分，COS周期中仅空泡较少的胚胎且空泡直径<14 μm的胚胎用于移植或冷冻；研究发现冷冻有小空泡的胚胎解冻后通常空泡体积会变大、数量会增多，隔夜培养后本无空泡的胚胎也可能产生较多空泡甚至整个胚胎空泡化。因此，本研究对这类胚胎移植后的临床结局进行分析，将有助于判断解冻复苏胚胎的种植潜能以及是否需要再次解冻剩余胚胎移植。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2019年12月于重庆市遗传与生殖研究所就诊的行FET周期患者的临床资料。纳入标准：首次助孕且均为COS全胚冷冻周期；第1次行FET；子宫内膜厚度≥8 mm；胚胎时期为第3天(D3)胚胎。排除标准：微刺激方案；解冻后有胚胎卵裂球坏死、发育停滞的周期；合并存在影响胚胎种植的因素，如子宫内膜异位症、子宫腺肌症和宫腔积液。根据纳入/排除标准，由于FET移植2枚胚胎均有空泡的周期以及单胚胎移植且有空泡的周期样本量太小不纳入本次分析，因此本研究仅包括移植2枚D3胚胎且其中1枚有空泡的周期。

共纳入3 528个周期，其中胚胎冷冻复苏当时和隔夜培养后均无空泡形成的周期2 615个，为无空泡组；解冻复苏时即存在空泡的312个周期，为解冻时空泡组；复苏时无空泡，隔夜培养后出现空泡的601个周期，为培养后空泡组。根据移植时空泡卵裂球胚胎占卵裂球胚胎总数的比例分为两组，<30%组679个周期，≥30%组234个周期。

二、研究方法

根据患者情况选择适合的控制性促排卵方案、授精方式，常规进行胚胎培养。根据临床评估对于不适合鲜胚移植的患者行可利用胚胎全胚冷冻。冷冻胚胎选择标准：受精后第3天胚胎细胞数≥6，碎片<35%，卵裂球大小基本均匀。

1.胚胎冷冻和复苏：胚胎冷冻解冻均使用Kitazato试剂盒(加藤公司，日本)，按照说明书进行严格操作。冷冻操作时将胚胎放置于平衡液(equilibrium solution，ES)表面，室温下放置9～15 min，当胚胎恢复至最大程度时移入玻璃化冷冻液(vitrification solution，VS)中，反复吸放，1 min内将胚胎以最小液滴装载于冷冻载体上，液氮保存。胚胎解冻复苏时将冷冻载体取出，将胚胎置于试剂盒1液中1 min，2液中3 min，3液和4液中各5 min，待胚胎形态恢复后于囊胚培养液vitrolife G1中隔夜培养至第2天移植。

2.人工周期内膜准备方案：患者于月经周期的第 2～5天开始口服补佳乐(广州拜耳医药)准备内膜，连续用药14 d后B超监测子宫内膜厚度，内膜厚度达标后(≥7 mm)予黄体酮转化内膜，3 d后移植卵裂期胚胎。

3. 观察指标：冷冻前优质胚胎率=优质胚胎数/解冻胚胎数×100%；种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

4. 妊娠判断：移植后14 d行血清HCG检测，移植后24 d超声检查见孕囊、胚芽，移植后35 d超声检查心管搏动者确定为临床妊娠。

三、统计学分析

结 果

一、空泡发生时间对临床结局的影响

解冻时空泡组312个周期，培养后空泡组601个周期，无空泡组2 615个周期，3组之间年龄、体重指数(BMI)、不育原因、基础性激素水平、子宫内膜厚度及冷冻前优质胚胎率比较均无显著性差异(P>0.05)。但解冻时空泡组种植率显著低于无空泡组和培养后空泡组(P<0.05)；解冻时空泡组FET日空泡卵裂球胚胎比例显著高于培养后空泡组(P<0.05)；3组之间临床妊娠率和流产率比较均无显著性差异(P>0.05)。培养后空泡组与无空泡组相比各指标比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 空泡发生时间对妊娠结局的影响[(-±s)，%]

二、FET时空泡卵裂球胚胎比例对妊娠结局的影响

<30%组679个周期，≥30%组234个周期，无空泡组2 615个周期。3组之间年龄、不育因素、基础性激素水平、子宫内膜厚度、冷冻前优质胚胎率及流产率比较均无显著性差异(P>0.05)。≥30%组分别与其他两组比较，种植率和临床妊娠率均显著降低(P<0.05)；<30%组与无空泡组比较各指标均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 FET时空泡卵裂球胚胎比例对妊娠结局的影响[(-±s)，%]

讨 论

一、空泡形成的原因和机制

空泡形成是胚胎体外培养过程中胞质异常的常见现象，但空泡形成的原因和机制目前尚无定论。主要原因有：胞质发育不成熟[3]，患者自身年龄、基因表达异常以及体外培养环境影响[4]。有学者推测空泡是由卵泡膜不稳定或闭锁造成的异常内吞作用所致，其内充满与卵周隙内成分相同的液体[5]。

二、空泡发生时机对胚胎发育及临床结局的影响

空泡对胚胎发育的影响存在争议，且将空泡作为独立因素分析其对胚胎发育和妊娠结局影响的研究更少。多个研究发现卵母细胞内空泡可能会影响细胞骨架功能的发挥，从而显著影响受精[6-7]和正常的细胞卵裂过程，甚至导致胚胎发育阻滞[6，8]。有研究表明卵母细胞和卵裂期胚胎的胞质空泡显著影响囊胚形成率和优质囊胚率[6，9-10]；认为胞质空泡可作为临床预后不良的指标[11]。但也有研究认为卵母细胞和卵裂期自发空泡的形成并不降低早期胚胎的质量及发育潜能[12]。即使卵母细胞胞质内含有大量的空泡仍具有正常受精和发育为健康胎儿的能力[13]。

研究显示胚胎致密化阶段是空泡形成的高峰期，优质胚胎在受精后第4天出现空泡的阳性率为42.6%[14]，因此空泡形成可能是胚胎致密化后促进融合形成囊胚的另一种方式[6，15]。且研究发现第5天大部分的空泡存在于滋养层细胞中，内细胞团中存在的空泡似乎存在自我修复机制[6，16]。有空泡的卵裂球可能不会参与胚胎致密化过程或少量的卵裂球参与并不会影响整个胚胎继续发育的能力，但如果空泡化的卵裂球位于紧密连接细胞之间时可能会影响其它正常细胞之间的连接[14]。2016年Nottola等[17]通过透射电子显微镜研究发现所有冷冻的卵母细胞复苏过程中均出现胞质空泡形成的现象，且在解冻复温中期空泡直径达到最大，而新鲜的正常成熟卵母细胞则不会出现类似情况，由此推测冻融过程中发生胞质空泡化可以认为是结构损伤的表现形式以及卵母细胞对冷冻损伤的应激反应。本研究对空泡出现的时机进行分析，结果表明解冻时空泡组FET日空泡卵裂球胚胎比例显著高于培养后空泡组，且FET后对胚胎种植的影响较大，提示胚胎冷冻复苏过程中由于冰晶的形成导致细胞器损伤，空泡的形成可能是损伤的细胞器的聚集。研究结果还显示培养后空泡组的种植率、临床妊娠率及流产率与无空泡组比较无显著性差异，提示隔夜培养后空泡出现未明显影响胚胎种植潜能，说明此阶段产生的少量空泡可能是胚胎融合的一种方式，或者已形成的空泡在囊胚形成的过程中被吸收或者被排出胚胎外。

三、空泡多少对胚胎发育及临床结局的影响

大部分胞质空泡的研究未区分空泡的大小和数量以及是否合并其它的胞质异常，仅少量文献对空泡的大小和数量有报道。Ebner等[6]研究发现当空泡直径≥14 μm会显著影响卵母细胞的受精能力。Zhang等[14]通过时差显微镜观察空泡胚胎的发育潜能，发现胚胎中含空泡的卵裂球越多胚胎的发育能力越差。本研究通过计算有空泡卵裂球占胚胎卵裂球总数的比例探讨空泡卵裂球的多少对胚胎种植的影响，结果表明FET日空泡卵裂球胚胎比例≥30%时移植后种植率显著下降，但流产率尚无显著性差异。

目前全胚冷冻患者在无特殊情况下均选择移植两枚卵裂期胚胎以提高妊娠率，胚胎冷冻解冻过程对胚胎的损伤无法避免，解冻时胚胎中存在的空泡经隔夜培养后空泡卵裂球胚胎比例会显著增多，且当空泡卵裂球胚胎比例≥30%时会显著影响胚胎的种植潜能，因此移植前可以参考空泡卵裂球胚胎比例和出现时机考虑是否需要解冻剩余胚胎移植。