牛乳清粉延缓D-半乳糖衰老小鼠衰老的相关机制研究

陈兴浩，巫首燕，曹佳怡，刘 庆，甘玉芬，张福梅

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 实验教学部，甘肃 兰州 730030；3.甘南牦牛乳研究院，甘肃 合作 747000）

人口老龄化是当前世界各国共同面临的重大课题。联合国《2019世界人口展望》[1]显示：我国自2002年（65岁及以上的老年人口占总人口的7.08%）进入“老龄化社会”，预计2025年、2035年分别进入“老年社会”和“超高龄社会”（ 65岁及以上的老年人口占总人口的14%时，称之为“老年社会”；当超过20%即进入了“超高龄社会”）。到21世纪中叶将有5亿人口超过60岁，步入深度老龄化阶段[2]。由于医疗保健、疫苗接种和卫生条件的改善我国老龄化人口规模将在未来很长一段时间内维持持续增长[3]。为了积极应对这一世界性难题，我国中共中央、国务院于2019年11月印发了《国家积极应对人口老龄化中长期规划》，推动“健康中国”。探究衰老相关机制，寻找延缓衰老的方法，维持老年人较高的生活质量已成为各行业的重中之重。

衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构的退行性变和机能的衰退，适应性和抵抗力减退[4，5]。衰老的相关机制至今尚未完全阐述，国际公认氧化应激是发生衰老的重要原因之一[6-8]。当机体处于不良外界环境或随着年龄的增长导致机体内氧化剂和抗氧化剂的动态平衡被打破，更有利于氧化剂的产生，将会导致构成细胞组织的各种物质如糖类、脂质、蛋白质、DNA等发生氧化反应，从而引起变性、交联、断裂等氧化伤害，进而引发疾病。抗氧化剂可清除自由基及抑制脂质过氧化，调整及改善机体生理功能，从而达到预防及治疗慢性疾病的目的[9]。

乳清蛋白（whey protein，WP）利用生产干酪和干酪素的副产物——乳清经分离、浓缩获得[10]，是国际公认的天然抗氧化剂[11]。乳清蛋白主要包括 β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和糖巨肽及少量的乳过氧化物酶、乳铁蛋白、β-微球蛋白、溶菌酶、胰岛素样生长因子（IGF）、λ-球蛋白等[12]。乳清蛋白中不仅含有具有广谱抗微生物和抗菌特性的组分，乳铁蛋白还可通过胃蛋白酶产生一种抗菌肽，除具有促进蛋白质合成、矿物质吸收、修复损伤等作用外，还具有广谱抗菌[13，14]、降低血糖和血脂水平等维持机体健康的作用。

因此，本实验通过研究牛乳清蛋白体内外抗氧化性，探讨其在延缓D-半乳糖诱导的衰老中的作用机制，以期为老年人补充乳清蛋白提高生活质量提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性昆明小鼠（由兰州大学基础医学院动物中心提供）。

超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；VC、D-半乳糖购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

多功能酶标仪、高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；蛋白印迹免染检测分析系统购自时代联想生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳清蛋白的制备 将鲜牛乳于低温离心机（4℃），5 000 r/min，离心30 min。获得上层乳脂部分和下层乳清、乳粒部分。弃去上层乳脂，脱脂乳在室温下用1M的HCl调至pH 4.6，40℃水浴20 min，8 000 r/min离心20 min（4℃），收集上清液（乳清）。冷冻干燥，-4℃保存备用。SDS-PAGE电泳对牛乳清蛋白进行分析。

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）按照BIO-RAD公司TGX and TGX Stain-Free Fast Cast说明配置12% SDS-PAGE胶，取蛋白样与SDS上样缓冲液（4×）混合，沸水浴10 min，使蛋白变性；上样；连接好正负极，起始电压100 V，约30 min；待其进入分离胶，120 V，60 min，至溴酚蓝条带到达分离胶底部，使蛋白样品充分分离。取出凝胶直接放在BIO-RAD凝胶成像分析系统的黑板上，调节好胶的成像面积，选择protein gel，stain free gel，选择曝光条件，激活45 s，成像。

1.3.3 牛乳清蛋白体外抗氧化活性的测定 以灵敏度最高的DPPH自由基清除能力测定实验检测牛乳清蛋白的抗氧化活性。取样品溶液2 ml加入等体积0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30 min，酶标仪517 nm处测定At。同法取2 ml蒸馏水加入等体积 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液测定吸光度记为A0。取2 ml样品液加入2 ml乙醇混匀，在517 nm处测定吸光度为Ab，按照以下公式计算DPPH自由基清除能力：

表1 牛乳清蛋白干预衰老小鼠实验分组

式中：At为样品溶液与DPPH乙醇溶液混匀所测得的吸光度值；A0为蒸馏水与DPPH乙醇溶液混匀所测得的吸光度值；Ab为样品溶液与乙醇溶液混匀所测得的吸光度值

1.3.4 牛乳清蛋白体内抗氧化活性的测定

1.3.4.1 衰老动物模型制备。选25～30 g健康成年雌性昆明小鼠30只，颈背部皮下注射10%的D-半乳糖生理盐水注射液0.25 ml/20 g，每日1次，连续42 d，制备衰老小鼠。

1.3.4.2 实验分组。牛乳清蛋白干预衰老小鼠实验分组（见表1）。

1.3.4.3 指标检测。乳清蛋白干预7 w后，检测体重。小鼠断头采血，4℃静置2 h，离心3 500 r/min，15 min。按说明书检测血清中SOD和MDA。小鼠解剖分离胸腺，称重。

式中：M1为胸腺重量；M2为小鼠体重

2 结果

2.1 牛乳清蛋白SDS-PAGE电泳结果

乳清蛋白在SDS-PAGE中主要显示出有4条主要的条带，相对应Marker主要分子量位于14.4～116KDa，从图1中可以看出，4条主要的蛋白条带分别为分子量为14.1 KDa的α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA），18 KDa的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG），免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）裂解的Ig-H（重链）和80KDa的乳铁蛋白（lactoferrin，LF）等。

图1 牛乳清蛋白SDS-PAGE电泳图

2.2 牛乳清蛋白体外DPPH自由基清除能力的测定

DPPH是一种稳定的自由基，在乙醇溶液中的DPPH呈紫色，在517 nm处有最大光吸收，DPPH自由基清除反应的程度取决于抗氧化剂的清除能力，由于该方法测定简单，所以广泛应用于自由基清除能力的测定。

图2 牛乳清蛋白体外DPPH自由基清除能力测定图

由图2显示，牛乳清蛋白对DPPH自由基的清除能力随着样品浓度的增加而升高，在一定浓度内呈量效关系。阳性组VC与BHT对DPPH自由基的清除能力在0～4 mg/ml范围内明显高于乳清蛋白，但在牛乳清蛋白4～6 mg/ml时乳清蛋白与阳性组的差别不大，尤其是乳清蛋白和BHT之间差别较小，当浓度为4 mg/ml时，乳清蛋白的清除率为72.26%、BHT的清除率为78.87%、VC的清除率为87.81%；当浓度为6 mg/ml时，乳清蛋白的清除率为79.51%、BHT的清除率为84.34%、VC的清除率为95.33%。

2.3 牛乳清蛋白对衰老小鼠体重的影响

由图3可知，正常对照组、不同剂量牛乳清蛋白和VC干预衰老小鼠后，体重增长率与干预时间均呈正相关，且正常对照组增长率最高，牛乳清蛋白组和VC阳性对照组体重增长率相似，无统计学差异。与之相对应仅衰老小鼠组体重增长率与干预时间呈负相关，并与其他组间有统计学差异。

图3 不同剂量牛乳清蛋白干预衰老小鼠体重增长率的变化图

2.4 牛乳清蛋白对衰老小鼠胸腺指数的影响

胸腺是动物体内重要的淋巴器官，具有重要的免疫作用，同时也是动物体内最先衰老的器官，从动物体内胸腺的比重可从侧面看出动物衰老的程度。由图4显示，不同剂量牛乳清蛋白和VC干预组衰老小鼠的胸腺指数与正常对照组无统计学差异，而衰老组小鼠胸腺指数下降较大。说明牛乳清蛋白可以延缓衰老过程中免疫功能的降低。

图4 不同剂量牛乳清蛋白干预衰老小鼠胸腺指数的变化图

2.5 牛乳清蛋白干预衰老小鼠后，小鼠血清氧化应激标记物的变化

由图5中结果可知，衰老组（NS）相比其他各组血清中MDA含量明显增高，而SOD活力却显著下降，且均具统计学意义。牛乳清蛋白低剂量组、VC阳性组和正常组相比血清中MDA含量、SOD活力相似，无统计学意义，而牛乳清蛋白高剂量组(CWPH)血清中MDA含量更低，SOD活力更高。说明牛乳清蛋白体内具有较好的抗氧化活性，且高浓度组较VC阳性组抗氧化性更强。

图5 不同剂量牛乳清蛋白干预衰老小鼠，小鼠血清中SOD活力和丙二醛（MDA）含量的变化图

3 讨论

3.1 牛乳清蛋白体外抗氧化性

DPPH自由基清除能力测定是最常用的体外抗氧化性评价方法。本实验以VC和BHT为阳性对照，梯度稀释牛乳清蛋白，发现在0.5～6 mg/ml范围内，DPPH自由基清除能力随牛乳清蛋白浓度的增高而增强。这一结果与Ahmed S Gad[15]和Yong-Eun Kim[16]等研究结果相一致：WP体外抗氧化活性呈剂量依赖。

3.2 牛乳清蛋白体内抗氧化性

机体细胞内，新陈代谢过程会产生自由基，同时体内抗氧化系统会有效地消除自由基。然而，由于自由基的过量产生，或抗氧化剂的消耗，体内这种平衡被打破，细胞暴露于高水平的自由基压力下，机体发生氧化应激，导致诸如脂质过氧化、DNA链断裂、氨基酸外消旋或脱羧、酶功能障碍和碳水化合物氧化分解[17]等细胞损伤。而持续的氧化应激被认为是衰老及其相关疾病[18-20]，癌症[21,22]、心血管疾病[23,24]、糖尿病[25,26]等多种慢性疾病的致病因素。

抗氧化物活性物质可以提高机体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GSH)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量，从而抑制由此诱导的衰老[27]。WP 的β-乳球蛋白[28]不仅自身具有较强的清除自由基、抗氧化的活性，而且在体内可以水解成多种抗氧化肽段；另外，乳铁蛋白能抑制由铁诱导的脂质过氧化产物硫代巴比妥酸和丙二醛的生成；乳白蛋白、乳铁蛋白等富含胱氨酸残基，能通过消化道进入细胞膜，还原成 GSH 的原料半胱氨酸，维持细胞和组织 GSH 水平，从而增强机体抗氧化能力[29]。

本实验根据小鼠血清内MDA的含量反映机体脂质过氧化速度、强度和组织过氧化程度，SOD的活力反映出机体内清除自由基的能力，也就是机体体内抗氧化的能力。实验结果证明，衰老组小鼠MDA含量升高，SOD活性则降低，而添加牛乳清蛋白后与衰老组小鼠各项指标结果相反，且有显著差异；牛乳清蛋白干预两组与VC阳性对照组结果无显著差异。证明牛乳清蛋白在体内具有抗氧化活性，是一种天然、无害、营养价值高的抗氧化补充剂。

3.3 牛乳清蛋白对衰老小鼠免疫力的影响

大量研究显示，乳清蛋白中的乳铁蛋白和糖巨肽等成分均具有较好的免疫调节作用[30]。胸腺是机体重要的免疫器官，主要参与细胞免疫。胸腺指数可以在一定程度上反应机体免疫功能的强弱。本研究显示，不同剂量牛乳清蛋白和VC干预组小鼠的胸腺指数与正常对照组无统计学差异，而衰老组小鼠胸腺指数下降较大。说明牛乳清蛋白可以延缓衰老过程中免疫功能的降低。

综上所述，该研究结果证明牛乳清蛋白和VC比较，体内外抗氧化和增强机体免疫力等作用相仿，且在补充量为400 mg/kg时部分指标优于VC。表明牛乳清蛋白可以作为一种天然、无害、营养价值高的抗氧化补充剂，并延缓D-半乳糖诱导的衰老。该研究为提高老年人群合理补充牛乳清蛋白，提高生活质量提供了基础研究数据。