PCR检测不同样品中牛羊布鲁氏菌病的对比试验研究

王 佳,关红民,豆思远

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046；2.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006）

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏杆菌侵入动物机体引起的慢性细菌性人兽共患传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物传染疫病[1]。该病主要侵害动物机体的生殖器官，严重影响畜牧业发展和食品卫生安全，危害人类健康，阻碍对外贸易[2]。布鲁氏菌病是当前一种严重威胁公共卫生事业和畜牧业发展的人兽共患传染性疾病[3]。常用的布鲁氏菌病病原学检测方法中，PCR检测是一项技术成熟、时间短的快速检测方法，但PCR检测方法与检测试剂所要求的样品以组织样为主，采集过程存在人员感染和环境污染的风险[4，5]。鉴于此，本研究通过对不同样品中牛羊布鲁式菌病的分析研究，旨在筛选出检测结果准确、可操作性强，可替代组织和血液的样品，以期降低牛羊布鲁氏菌病采样、检测和废弃物处理中人员的感染风险，为准确检测牛羊布鲁氏菌病的感染情况提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品及数量

样品采自29头牛、18只羊。采集组织样品15份，奶牛11份、羊4份。奶牛鼻腔拭子20份、生殖道拭子12份，羊鼻腔拭子8份、生殖道拭子16份，拭子样品共计56份。鼻腔拭子、生殖道拭子分别用PBS和0.5%石碳酸生理盐水缓冲溶液保存。采集尿液42份，奶牛29份、母羊13份。各种样品采集数量详见表1。

1.2 试剂

布鲁氏菌病PCR试剂盒购自北京世纪元亨生物制品有限公司，批号为：201301G25。PBS溶液实验室自制，浓度为0.01 mol/L，pH值为7.4。

1.3 样品制备

组织和分泌物加PBS液1 ml，研磨处理后取上清液100 μl，拭子样品取PBS浸液和0.5%石碳酸生理盐水浸液各100 μl，加入200 μl消化液和和20 μl蛋白酶K，震荡混匀后，置于56℃水浴消化1 h。

表1 奶牛和羊PCR检测样品数量（单位：份）

表2 PCR检测不同样品中奶牛和羊布鲁氏菌病测定结果

表3 PCR检测不同类型样品测定结果

1.4 DNA提取（滤膜法）

1.4.1 从水浴锅中取出样品降至室温，加入300 μl的DNA结合液混匀，将全部液体移入吸附柱中，室温静置3 min，10 000 rpm离心30 s。

1.4.2 弃去收集管中液体，加入500 μl DNA洗涤液，10 000 rpm离心30 s。

1.4.3 重复上一步。

1.4.4 弃去收集管中液体，10 000 rpm空柱离心1min，除去残留DNA洗涤液。

1.4.5 将吸附柱放入新的1.5 ml离心管中，50 μl洗脱液洗脱模板。

1.5 扩增条件

扩增体系每份总体积为20μl，含16μl的PCR反应液、2μl的Taq DNA聚合酶、2μl模板DNA。扩增条件：94℃用时3 min；循环94℃用时30 s，60℃用时30 s，72℃用时30 s，共35次；72℃延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 组织中牛羊布鲁氏菌病检测结果

由表2、表3可知，检测组织样品15份，奶牛阳性数为10份，羊阳性数为3份，奶牛布鲁氏菌病感染率为90.91%，羊布鲁氏菌病感染率为75.00%，组织样品中牛羊布鲁氏菌病的平均感染率为86.67%。

2.2 鼻腔拭子中牛羊布鲁氏菌病检测结果

从表2、表3、图1、图2可知，PBS保存的鼻腔拭子样品15份，检出阳性11份，奶牛布鲁氏菌病感染率为72.73%，羊布鲁氏菌病感染率为75.00%。PBS保存的鼻腔拭子布鲁氏菌病的平均感染率为73.33%；0.5%石碳酸生理盐水保存鼻腔拭子13份，检出阳性10份，奶牛布鲁氏菌病感染率为77.78%，羊布鲁氏菌病感染率为78.00%，0.5%石碳酸生理盐水保存的鼻腔拭子布鲁氏菌病的平均感染率为76.92%。鼻腔棉拭子中牛羊布鲁氏菌病的平均感染率为75%。

图1 牛鼻腔拭子中布鲁氏菌病PCR扩增结果（部分样品）

图2 羊鼻腔拭子中布鲁氏菌病PCR扩增结果

2.3 生殖道拭子中牛羊布鲁氏菌病检测结果

由表2、表3、图3、图4可知，PBS保存的生殖道拭子15份，检出阳性12份，奶牛布鲁氏菌病感染率为85.71%，羊布鲁氏菌病感染率为75.00%，PBS保存的生殖道拭子布鲁氏菌病的平均感染率为80.00%；0.5%石碳酸生理盐水保存生殖道拭子13份，检出阳性11份，奶牛布鲁氏菌病感染率为80.00%，羊布鲁氏菌病感染率为87.50%，0.5%石碳酸生理盐水保存的生殖道拭子布鲁氏菌病的平均感染率为84.62%。生殖道棉拭子中牛羊布鲁氏菌病平均感染率为82.14%。

2.4 尿液中牛羊布鲁氏菌病检测结果

从表1、表2、图4可知，检测奶牛尿液29份，检测出阳性21份，感染率为72.41%；检测母羊尿液13份，检测出阳性10份，感染率为76.92%。

3 讨论

试验研究表明，牛羊的组织、鼻腔拭子、生殖道拭子及尿液中均可检测出布鲁氏菌。在组织样品中，奶牛布鲁氏菌病的感染率高于羊。用0.5%石碳酸生理盐水保存的鼻腔拭子，奶牛和羊布鲁氏菌病的感染率均高于PBS保存的拭子。用PBS保存的生殖道拭子，奶牛布鲁氏菌病的感染率高于石碳酸生理盐水保存的拭子，两种保护液中的羊生殖道拭子，布鲁氏菌病的感染情况与奶牛相反。用同种保护液保存的牛羊鼻腔拭子和生殖道拭子，生殖道拭子的感染率高于鼻腔拭子。用两种保护液保存的牛羊同种拭子，0.5%石碳酸生理盐水保存的拭子感染率高于PBS。尿液中，母羊布鲁氏菌病的感染率高于奶牛。

图3 牛生殖道拭子中布鲁氏菌病PCR扩增结果（部分样品）

图4 羊尿液、牛生殖道拭子中布鲁氏菌病PCR扩增结果（部分样品）

通过检测分析不同样品中牛羊布鲁氏菌病的感染情况可知，样品检出率从高到低顺序为组织样品、生殖道拭子、鼻腔拭子、尿液。采用PCR方法检测鼻腔拭子和生殖道拭子，拭子样品保存在0.5%石碳酸生理盐水中，可降低采集组织样品和血液样品造成人员感染牛羊布鲁氏菌病的生物安全威胁，提高牛羊布鲁氏菌检测的准确性。