Hela细胞裸鼠模型中肾脏VEGF的表达

郭丽娜，冯法铭，韩禹婷，张绍广，王家敏，乔自林，杨 琨*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)简称VEGF，是具有高度特异性的促进血管内皮细胞生长的因子，有增强血管通透性、促进血管内皮细胞迁移增殖、增加细胞外基质变形和血管形成等作用。VEGF家族成员以结合抗体的方式来激活血管生成信号通路，调控血管内皮细胞迁移增殖、分化的相关生理正常和生理异常微环境。有三个主要促进血管生成的过程即血管发生、血管生成、动脉生成。VEGF对肿瘤血管结构的生成、维持和改建具有重要意义，为肿瘤细胞在生长微环境中增殖、浸润和转移提供有利条件[1]。与肿瘤的生长转移有密切联系。

科学研究表明，造成恶性肿瘤患者死亡的主要原因是肿瘤转移。一项研究表明，大约90%的癌症死亡是由转移形成引起的[2]。恶性肿瘤转移过程包括从恶性肿瘤原发部位脱离侵入周围的基质，进入淋巴管、体腔或血管，黏附在内皮细胞壁并迁徙到其他部位继续生长，导致血管增生并形成与原发部位同样类型的肿瘤。在肿瘤转移过程中新血管的形成是肿瘤生长转移和传播的一种基本活动。

肾脏组织中，血管内皮生长因子主要由肾小管上皮细胞和肾小球足细胞产生，在抗间质纤维化，保证肾小管周围毛细血管网结构与功能稳定，以及肾小球滤过膜结构完整等方面起到了非常重要的调控作用[3]。血行转移在肿瘤转移中占重要地位，肾脏作为泌尿器官，以肾小球毛细血管球过滤血液的形式生成尿液，此时血液中肿瘤特异性生长因子通过肾小球过滤作用可能留在肾脏中，进而形成转移灶。

本实验通过免疫组化染色方法定位分析血管内皮生长因子在肾脏中的表达来反应肿瘤的转移情况，研究VEGF在Hela细胞注射裸鼠肾脏中的表达分布情况，为进一步揭示VEGF蛋白在裸鼠成瘤过程中的调节机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物用到免疫功能缺陷裸鼠：10只，4周龄雌性（BALB/c裸鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司）。

1.2 试剂与仪器

购于国家实验细胞资源共享服务平台的Hela细胞悬液；购于北京索莱宝科技有限公司的免疫组织化学检测试剂盒（SP-0023）和DBA浓缩型显色试剂盒，试验所用一抗（兔VEGF多克隆抗体）及二抗（山羊抗兔）均购自北京博奥森技术有限公司。主要仪器有病理组织切片机、温箱、组织摊烤片机、显微镜照相系统等。

1.3 免疫功能缺陷裸鼠异种移植Hela细胞动物模型的建立

Hela细胞连续传代培养150代，建立并储存于低温保存介质中。通过皮下注射免疫缺陷裸鼠（BALB/c裸鼠）建立10只动物模型。裸鼠初始体重为16～19 g，接种数10只，皮下接种200 ml Hela细胞悬液，相当于1.0×107/ml活细胞，饲养时间60 d。

1.4 组织采集与固定

10只试验裸鼠均成瘤，瘤体直径超过1cm或者满60 d即处死，并迅速进行病理解剖，收取瘤体，肾脏等组织器官样本，及时放于4%多聚甲醛中固定12 h后更换固定液存放。

1.5 HE染色

组织固定好后，修割成1 cm3的小块，进行包埋。使用病理组织切片机对包埋好后的石蜡块进行切片，粗切厚度为20μm，细切厚度为5μm。将切好的组织于组织摊烤片机中展片，展片后用60℃烤片，烤至组织周围石蜡融化即可进行染色，包括脱蜡、染色、脱水透明一系列步骤，最后使用中性树脂进行封片。

1.6 免疫组化SP染色

石蜡切片（5 μm）烤片后脱蜡至水，蒸馏水和PBS（磷酸缓冲盐溶液）分别浸泡5 min；经抗原修复（柠檬酸盐缓冲液-微波热修复法）、阻断、封闭后滴加一抗工作液孵育（37℃湿盒中）；随后二抗（B液）、三抗（C液）反应后，滴加DAB显色液，在显微镜下观察至显色明显立刻冲水停止反应；接着用苏木精复染、盐酸酒精分化、自来水冲洗反蓝、脱水、透明、封片即可。其中，阻断用液、封闭用液、二抗和三抗工作液来自免疫组化SP试剂盒；一抗来自兔GnRH多克隆抗体（工作浓度1：400）。

2 结果

2.1 Hela细胞接种裸鼠肾脏组织学观察

由图1A所示，在HE染色100倍的视野下肿瘤裸鼠肾脏组织结构完整，为肾脏被膜和实质的皮质部分。毛细血管充血。图1B所示为HE染色200倍，可见视野中肾小体内含有大量血细胞，静脉管中充盈着大量血液，肾小管管腔狭窄，呈淀粉样变性且出现自溶现象。于肾间质中发现少量地从骨髓发育而来的B淋巴细胞，可能与肿瘤的生长、移植有关。

图1 A和B为Hela细胞接种裸鼠肾脏组织HE染色图片

2.2 Hela细胞接种裸鼠肾脏VEGF蛋白表达

由图2C所示，免疫组化染色中所加兔VEGF多克隆抗体与肿瘤裸鼠肾脏中VEGF抗原结合呈棕黄色阳性反应，在肾脏皮质中VEGF蛋白主要于肾小管上皮细胞中的表达，肾小体中弱表达。图D同部位200倍视野下可见肾小管管腔变窄，出现自溶现象。

图2 C和D为Hela细胞接种裸鼠肾脏组织VEGF蛋白免疫组化染色

3 讨论

本研究得出，HE染色下肿瘤裸鼠肾脏出现毛细血管充血，肾小管管腔狭窄、自溶及淀粉样变性，病理变化可能与肿瘤的生长、转移有关。免疫组化染色中，VEGF在Hela细胞肿瘤裸鼠模型肾脏的肾小管上皮细胞和肾小体中毛细血管球中均呈阳性表达，但在肾小管上皮细胞中呈强表达，肾小体毛细血管球次之。这是因为VEGF是肾脏血管形成的主要调节因子，并在肾小管上皮细胞和肾小球足细胞中广泛表达[4]，但足细胞数量少于肾小管上皮细胞数量，因此视觉上肾小管上皮细胞血管内皮生长因子表达量强于肾小囊毛细血管球的血管内皮生长因子表达量。

研究表明，在动物生理异常或正常状态下，血管通透性增加主要依赖于VEGF通过旁分泌方式来促进，将刺激因素对内皮细胞的刺激作用扩大，血浆蛋白的外渗得到促进，新生血管的临时基质在此时形成，为新血管生成创造条件。在肿瘤中，VEGF及其受体高度表达。通过引起一系列信号传导来刺激血管内皮细胞增殖，多种肿瘤血管新生的起始和延续中均有VEGF参与，以促进新血管和肿瘤的生长，与肿瘤新生血管的形成数目息息相关[5]。

VEGF家族的机制复杂，在体内的作用多种多样，VEGF生物学功能活性包括：一是增加血管通透性：VEGF在引起血管通透性增加的物质中是作用最强烈的，血管通透性的增加为肿瘤细胞的生长以及新血管生成所需营养物质和血管支持物创造了有利的条件；二是刺激血管内皮细胞分裂、重建和增殖；三是抑制肿瘤细胞的凋亡；四是促进形成血管外临时基质。因其在肿瘤生长、转移过程中具有重要意义可以作为早期肿瘤检测指标之一。目前用于治疗肿瘤的靶向药物包含VEGF信号通路抑制剂，如可溶性VEGF-C、VEGFR-3和VEGF-3的中和抗体[1]。虽然VEGF信号通路抑制剂治疗肿瘤取得良好效果，但VEGF的上游基因是否调节和控制VEGF的表达，以及肿瘤淋巴管、血管生成是否有VEGF对其下游基因表达影响的原因仍不完全清楚，有待进一步验证。