不同成瘤性MDCK细胞中SQSTM1的差异表达验证

敖慧娟，郭寿清，阿依木古丽·阿不都热依木，杨 琨，乔自林，王家敏*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030 ；2.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030 ；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030 ）

MDCK细胞系由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel 母曲架犬的肾脏中分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。由于其病毒感染效率高、增殖快，不易变异，且适应与无血清的生长条件，MDCK细胞系被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一[1-3]。由于MDCK细胞本身具有较高的成瘤性，用其生产疫苗的安全性一直存在着争议[4，5]。据报道，MDCK细胞的成瘤表型是未知的，在诱发上皮-间充质转化和间充质-上皮转化的过程中都在诱导干细胞特性，且在肿瘤发生发展，迁移侵袭和转移中起作用[6]。近年来，科学家一直在尝试确定MDCK细胞作为流感疫苗基质的安全性，以便获得无肿瘤/低肿瘤的MDCK单克隆细胞株用于流感疫苗的开发，本课题组通过单细胞克隆培养和筛选，得到了数株低成瘤性的MDCK细胞株，将其与实验室已有的高成瘤性细胞株一并做高通量分析发现，某些经典的肿瘤通路被靶基因激活，其中lncRNA MSTRG.1056.2直接调控ERBB3激活PI3K-Akt通路，促进肿瘤发生[7，8]。

SQSTM1蛋白被证实与肿瘤的发生、发展密切有关，该蛋白包含促进与许多信号激活因子相互作用的结构域。3LC3相互作用区域（LIR）的存在使SQSTM1与LC3结合，泛素相关结构域（UBA）与泛素结合以介导选择性降解，SQSTM1的这种细胞质活性取决于其UBA结构域，但不依赖于其与自噬蛋白LC3的相互作用[9]。研究发现SQSTM1聚集于肝细胞癌、胰腺癌、肾癌、肺腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤中，且SQSTM1参与多种信号通路，因此其细胞水平至关重要[10]。

SQSTM1在乳腺癌肿瘤干细胞高表达进而诱导肿瘤复发和耐药，在肿瘤细胞和肿瘤基质中的表达相反，高表达于肿瘤细胞中，而在肿瘤基质中表达水平下调，提示SQSTM1在肿瘤微环境中发挥了重要作用[10]。因此，对不同成瘤性MDCK细胞中SQSTM1的差异表达及功能的研究具有重要意义。

1 方法

1.1 不同成瘤性细胞的复苏与培养

本实验所选取的不同成瘤性细胞株是由课题组在前期实验中驯化所得。前期裸鼠成瘤性实验中发现：从ATCC引进的贴壁型MDCK-A和由其驯化所得悬浮型MDCK-B在裸鼠成瘤性实验中的成瘤率均高达100%（10/10）；而将MDCK-A通过有限稀释法制备得到的贴壁型单克隆细胞株MDCK-C的裸鼠成瘤率为10%（1/10）；MRC-5细胞由兰州民海生物工程有限公司赠送，其裸鼠成瘤率为0%（0/10）。因此，选用MRC-5作为阴性对照。

将本实验室已有的不同成瘤性MDCK细胞从液氮罐中取出，置于37℃温水中直至完全融化，将悬浮型MDCK-B用无血清培养基置于37℃，5%二氧化碳，转速为120 r/min的摇床上培养，并将贴壁型细胞MDCK-A，MDCK-C，用含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，对照组MRC-5细胞含10%新生牛血清的MEM培养基，用置于37℃，5%二氧化碳恒温培养箱中培养。

1.2 TRIzol Reagent 总RNA提取

弃掉细胞培养瓶中的培养液，用PBS洗3遍，并吸去残余的PBS。加入TRIzol试剂，用枪尖用力吸打裂解细胞，室温放置5 min以彻底解离蛋白复合体。将细胞与裂解液分装至2个1.5 ml的已高压的无RNA酶PE管中，加入氯仿使其与TRIzol的体积比为1：5。用力上下摇20 s左右，室温静置3～5 min，再用4℃离心机12 000×g离心10～15 min，并小心吸取上层水相到新的已高压的无RNA酶PE管中，加入100%异丙醇到水相中，使得异丙醇与TRIzol的体积比为1：2。室温放置8～10 min以沉淀RNA。再用4℃离心机12 000×g离心8～12 min后，小心弃上清，防止将RNA沉淀一并弃掉。同1 ml75%的无水乙醇漂洗RNA沉淀，即无水乙醇与TRIzol的体积比为1：1。将无水乙醇中的RNA在4℃离心机中以7 500～8 000×g离心5～6 min。小心吸去无水乙醇，并打开EP管的盖子，室温干燥RNA沉淀5～8，注意不可完全干燥。用DEPC水30～50μl溶解RNA沉淀，用枪尖反复吹打以彻底增加RNA溶解。吸取1～3μl RNA测量所提RNA样品A260/A280的OD值。

1.3 Real Time PCR

在做Real Time PCR 之前，需要将样品RNA反转录为cDNA，艾科瑞生物公司的EVO M-MLV反转录试剂盒，具体反应体系见表1、表2。

表1 去除gDNA试剂及反应体系

混匀后短暂的离心，再将样品放入PCR 仪中42 ℃2 min。取出样品放置在冰上加入发转录试剂。

表2 反转录试剂及反应体系

混匀后短暂的离心，再将样品放入PCR 仪中37℃15 min，85℃5 s，以上过程就是将样品RNA反转录为cDNA的全过程。将得到的cDNA保存于零下20℃。利用Primer 5.0软件根据目的基因设计所需要的引物，基因引物信息见表3。

表3 基因引物序列信息

将引物系列送到甘肃一棵树生物有限公司合成后，再用GeneCopoeia,Inc.的All-in-OneTMqPCR Mix-实时荧光定量PCR检测试剂盒对目的基因进行检测。其反应体系见表4。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，95℃10 s到72℃ 15 s 40个循环，溶解曲线分析为65 ℃ 10 s，95 ℃ 20 s，每个样品至少做了3个平行组。随后摇匀，瞬时离心后，用BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 分析目的基因在不同成瘤性MDCK 细胞中的表达量。2 h后可以根据反应结果使用相对定量分析 F=2-ΔΔCt进行数据分析。其计算方法为ΔCt=目的基因 Ct 值 - 内参基因 Ct 值 ；-ΔΔCt=对照组ΔCt平均值-各样品ΔCt值；最后2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平。利用GraphPad Prism 5作图分析目的基因的表达量并作差异性分析。

表4 荧光定量PCR反应体系

2 结果

2.1 不同成瘤性细胞的复苏与培养

根据细胞生长条件需要，对不同细胞采用不同的培养条件进行培养。将贴壁细胞培养48 h后置于显微镜下用4倍目镜观察细胞的生长状况，如图1所示，发现所培养细胞生长状态良好，细胞轮廓清晰，悬浮细胞的活力高、结团少、均一性好。其中MRC-5（图A）成纤维状生长；贴壁型MDCK-A（图B）成上皮样生长；悬浮型MDCK-B（图C）呈圆形悬浮生长于无血清培养基中，MDCK-C（图D）成上皮样生长；可用于后续实验。

图1 细胞的复苏与培养结果

2.2 TRIzol Reagent 提取不同成瘤性细胞总RNA的纯度分析

将提取的RNA进行纯度分析发现，所有样品OD值均在1.8～2.0之间，可用于后续实验。具体结果见表5。

表5 样品纯度检测结果

2.3 不同成瘤性细胞中SQSTM1基因表达量的分析

图2 引物特异性结果

RT-PCR检测结果显示：所设计的引物特异性高，定量结果重复性好（见图2），以MRC-5为对照组，发现SQSTM1在高成瘤性MDCK-A和MDCK-B中高表达，而在低成瘤性细胞株MDCK-C中较高成瘤性组大大降低（见图3）。说明SQSTM1在细胞内的表达量可能与细胞成瘤性成正相关，可为进一步研究SQSTM1在MDCK细胞成瘤性的作用机制研究提供理论参考。

图3 不同成瘤性细胞中SQSTM1的表达结果

3 讨论

在本研究中，挑选了前期实验室冻存的不同成瘤性细胞，旨在探究SQSTM1在不同成瘤性细胞中的表达量关系，进而为利用基因工程手段构建稳定的低成瘤细胞系奠定基础。结果表明：SQSTM1在高成瘤性MDCK细胞株MDCK-A和MDCK-B中的表达量远高于低成瘤性细胞株MDCK-C。这由MDCK细胞群的多样性扩展到了其成瘤性蛋白表达的差异，并为进一步开展SQSTM1在MDCK细胞中的成瘤性机制研究提供了参考信息。

MDCK细胞的成瘤性包括多个成瘤相关基因和抑癌基因的参与，从而导致细胞机制发生改变。据报道，将癌基因v-src转染到MDCK细胞后下调了细胞间的粘附，并刺激胶原凝胶的侵袭，导致细胞表型发生上皮-间充质的转变[11]。检测细胞表面明胶酶A其受体MT1-MMP的表达。发现MDCK细胞中原明胶酶A由潜伏状态变为活化状态，进而促进裸鼠成瘤[12]。另外ADAMTS12在MDCK细胞中可通过阻断Ras-MAPK信号通路的激活来阻止肝细胞生长因子（HGF）的成瘤作用，并且该调控涉及金属蛋白酶的血小板反应蛋白域。揭示ADAMTS12金属蛋白酶通过调节依赖于Ras的ERK信号通路显示抗肿瘤作用[13]。Galectin-8是在人类组织和癌症中表达最广泛的半乳糖凝集素之一。在之前的研究中Galectin-8具有抗肿瘤作用，诱导肿瘤细胞生长停滞和凋亡或抑其迁移和肿瘤的生长。但是将Galectin-8转染至MDCK中发现，Galectin-8可以通过FAK/EGFR/蛋白酶体途径诱导部分上皮-间质转化，具有侵袭性成瘤能力[14]。

SQSTM1 在转移性乳腺癌中高表达，可促进乳腺癌细胞的侵袭表型，其过表达与不良预后相关，干扰 SQSTM1可抑制乳腺癌的转移，并降低体内成瘤性[15]。SQSTM1的过表达可导致异常信号的激活和包括肿瘤发生的疾病。在生长因子诱导的正常细胞和肿瘤细胞EMT中积累。SQSTM1增加了参与EMT的TGFb信号和转录因子介体的稳定性[9]。但SQSTM1在MDCK细胞成瘤性的研究中少有报道。本研究结果可用于将来表征不同MDCK细胞的克隆及驯化，为研究MDCK细胞肿瘤生物学特征，以及评估MDCK细胞作为疫苗生产的试剂等目的提供了基础。