MT1G在中晚期肝细胞癌组织中的甲基化状态及对索拉非尼治疗预后的预测价值

（西安交通大学第一附属医院 肝胆外科，陕西 西安 710061）

据全球癌症统计报告分析，2018年全球新增肝癌患者841 080 例，死亡781 631 例，有近半数患者来自中国[1]，因此我国肝癌的防治形势十分严峻。肝细胞癌是我国常见的肝癌病理类型，早期确诊率较低，进入中晚期后由于患者基础状况差、缺乏手术指征，导致5年生存率低[2]。分子靶向制剂的出现为中晚期肝细胞癌患者带来了希望。索拉非尼是一类多激酶、多靶点抑制剂，可靶向抑制Raf 激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶等[3]。全球多项临床试验均证实索拉非尼作为晚期肝癌的一线用药，可明显延长患者的生存期[4]。但是长期大量用药导致患者耐受性降低，从而影响预后，因此如何提高肿瘤细胞对索拉非尼的反应性是医学界最新关注的热点。2016年，SUN 等[5]学者在权威杂志《Hepatology》上发表了1 篇文章，发现MT1G 通过抑制铁死亡，促使肝细胞癌对索拉非尼产生耐药性。MT1G 是一类具有高度保守结构的小分子蛋白质，通过与金属离子结合，诱导金属应答元件，调控相关基因的表达[6]。SUN 等[5]在文章中提出，索拉非尼可通过诱导一类新的细胞死亡途径——“铁死亡”发挥肝细胞癌杀伤作用，而MT1G 是“铁死亡”过程中重要的调节蛋白。目前关于MT1G 与肝细胞癌发生、发展的关系报道较少，TCGA 数据库为寻找有价值的基因提供了重要线索。在本研究首先在TCGA在线数据库中查询了MT1G 在肝癌组织中的表达及与患者生存期的关系，以此为基础，纳入在西安交通大学第一附属医院就诊，行索拉非尼治疗的中晚期肝细胞癌患者作为实验对象，进一步分析MT1G 与肝细胞癌患者临床病理特征及索拉非尼治疗反应性的关系，为深入了解肝细胞癌对索拉非尼的耐药机制提供一定的循证医学依据。

1 资料与方法

1.1 生物信息学分析MT1G 在肝癌组织中的表达及与预后的关系

利用TCGA 在线网站（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）检索MT1G 在肝癌组织中的表达及与预后的关系。

1.2 标本收集

调取在西安交通大学第一附属医院病理室保存的86 例病理组织蜡块，包括癌组织和相配对的癌旁组织（距离肝细胞癌组织＞2 cm）。所有蜡块来自2016年11月—2018年5月在本院接受肝切除术的中晚期肝细胞癌患者。其中，男性75 例，女性11 例；年龄34～81 岁，平均（61.17±12.54）岁。纳入标准：①符合手术指征，并手术切除；②术中发现或术后经病理证实为中晚期肝细胞癌；③符合巴塞罗那肝癌分期（BCLC）B 或C 期，肝功能Child-Pugh 分级为A 或B 级；④术后经影像学检查未见确切残留病灶；⑤术后接受索拉非尼治疗，且确定治疗前无复发；⑥术前未经放化疗及其他系统地抗肿瘤治疗；⑦预计生存时间≥3 个月。排除标准：合并其他重要器官功能障碍。本研究中所有病理标本的获取已获得医院医学伦理委员会的审核。

1.3 主要试剂及仪器

Envision 二步法试剂盒（美国Dako 公司），MT1G抗体（英国Abcam 公司），即用型二抗和DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），TIANamp FFPE DNA Kit（离心柱型）、甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific polymerase chain reaction,MSP）试剂盒（北京天根生化科技有限公司），EpiTect Bisulfite Kit（德国Qiagen 公司），5331 型PCR 仪（美国Eppendorf 公司）。

1.4 免疫组织化学法检测组织MT1G 蛋白

采用常规Envision 二步法检测MT1G 蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达。取病理切片60℃烤箱烘烤2 h，依次用二甲苯（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ）和梯度酒精（无水酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精）各5 min 脱蜡水化，置于柠檬酸钠缓冲液中加热进行组织抗原修复，滴加3% H2O2溶液封闭。滴加足量的MT1G 抗体（1 ∶100 稀释），置于湿盒中4℃孵育过夜，洗涤。滴加即用型二抗，DAB 显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，脱水，中性树胶封片。室温下干燥，由2 位以上病理科副主任医师盲法阅片。结果判定：以胞浆出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，少数阳性染色细胞也会出现细胞核着色。胞浆或胞核未出现棕黄色染色则为阴性。

1.5 MSP 检测MT1G 基因启动子甲基化状态

采用石蜡包埋组织DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取肝细胞癌组织DNA，用紫外分光光度计测定DNA 样本的纯度和浓度。取2.0μg DNA 样本，进行亚硫酸氢钠修饰和纯化。取2.0μl 纯化后回收的DNA 样本进行MSP 扩增。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸20 s，共计36 个循环，72℃继续延伸5 min，4℃保存。最后进行琼脂糖凝胶电泳。MSP 引物序列见表1。

表1 MSP 引物序列

1.6 治疗及随访

所有患者接受外科手术，在切除肿瘤的同时，根据癌栓位置取栓，术中若发现淋巴结转移则行淋巴结清扫。术后经主治医生评估接受索拉非尼治疗。甲苯磺酸索拉非尼片（商品名：多吉美，德国拜耳医药股份有限公司，规格：200 mg，注册证号：H20160201）初始口服剂量400 mg/次，2 次/d。因毒副作用酌情减量，发现疾病进展、复发、患者不耐受药物不良反应或死亡时停药。结合复诊病历或电话对患者或家属进行随访，随访时间截至2019年11月。主要研究终点为患者停药时间，次要研究终点为患者总生存期。疾病进展或复发时间为患者手术至CT 或MRI 检查发现肿瘤复发或转移的时间。总生存期为患者手术至患者死亡或随访截止时间。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。非正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较用秩和检验；计数资料以以率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Spearman 法；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析

检索TCGA 数据库结果显示，371 例原发性肝细胞癌组织[5 087.62（2 311.54，11 857.47）]和相配对的癌旁正常肝脏组织[40.21（16.54，986.4）]中MT1G 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（Z=6 579.571，P=0.000），原发性肝细胞癌组织低于癌旁正常肝脏组织（见图1）。另外MT1G 蛋白高表达者和低表达者总生存率分别为13.19%（12/91）和23.72%（65/274），中位生存时间分别为55.0 个月（1.0～117.0 个月）和56.0 个月（1.0～120.0 个月），经Log-rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.485，P=0.872）（见图2）。

图1 TCGA 数据库中原发性肝细胞癌组织与癌旁正常肝脏组织的MT1G 蛋白相对表达量比较 （n=371）

2.2 MT1G 蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达

经免疫组织化学法检测，86 例肝细胞癌组织样本和癌旁组织中MT1G 蛋白阳性表达率分别为34.88%（30/86）和65.51%（56/86），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=15.956，P=0.000），肝细胞癌组织低于癌旁组织。见图3。

图2 TCGA 数据库中不同MT1G 蛋白表达水平患者的预后

图3 MT1G 蛋白在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达（免疫组织化学法×200）

2.3 MT1G 基因启动子甲基化检测

经MCP 检测，肝细胞癌组织和癌旁组织MT1G基因启动子甲基化率分别为60.46%（52/86）和37.21%（32/86），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.307，P=0.002），肝细胞癌组织高于癌旁组织。见图4。

图4 MT1G 基因启动子甲基化状态

2.4 MT1G 蛋白阳性表达与MT1G 基因启动子甲基化状态的关系

经等级相关性分析，MT1G 蛋白阳性表达率与MT1G 基因启动子甲基化率呈负相关（rs=-0.787，P=0.000）。

2.5 肝细胞癌组织中MT1G 蛋白表达与临床病理特征的关系

不同Child-Pugh 分级、BCLC 分期和术前血清甲胎蛋白的肝细胞癌患者肿瘤组织中MT1G 蛋白阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；而不同性别、年龄、肝炎背景、肝硬化病史、肿瘤数目和直径、手术切除肝段的肝细胞癌患者肿瘤组织中MT1G 蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征肝细胞癌患者肿瘤组织中MT1G 蛋白阳性表达率比较 例（%）

2.6 肝细胞癌组织中MT1G 蛋白表达与索拉非尼停药时间、生存时间的关系

所有患者在术后20.0 d（5～52 d）开始服用索拉非尼，中位服药时间为17.0 个月（1.0～33.0 个月）。MT1G 蛋白阳性表达患者中位停药时间为15.0 个月（4.0～27.0 个月），MT1G 蛋白阴性表达患者为20.0 个月（1.0～33.0 个月），经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.248，P=0.002），MT1G 蛋白阳性表达患者停药时间较短。另外，中位随访时间为15.0 个月（4.0～40.0 个月）。见图5。

图5 MT1G 蛋白阳性与阴性表达患者的索拉非尼停药时间比较

随访期间，39 例患者死亡，中位生存时间为25.0 个月（4.0～40.0 个月），总生存率为54.65%（47/86）。MT1G 蛋白阳性表达患者中位生存时间为20.0 个月（11.0～38.0 个月），MT1G 蛋白阴性表达患者为25.0 个月（4.0～40.0 个月），经Log-rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=1.717，P=0.190）。同时，MT1G 蛋白阳性表达患者和阴性表达患者总生存率分别为43.33%（13/30）和60.71%（34/56），经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=2.381，P=0.123）。见图6。

图6 MT1G 蛋白阳性与阴性表达患者的生存时间比较

3 讨论

根据美国肝病学会诊疗指南和欧洲肝脏研究学会-欧洲癌症研究治疗组织临床实践指南推荐，对于BCLC 分期B、C 期肝癌患者建议实行肝动脉化疗栓塞术以延长患者的生存时间[7]。但是在实际临床中，部分中晚期患者具有良好的肝功能储备，同样可采取手术治疗。TORZILLI 等[8]对2 046 例中晚期肝癌患者（BCLC 分期B 期737 例，C 期287 例）进行术后随访，1年生存率约为70%。虽然手术治疗提高了中晚期肝癌患者的1年生存期，但是术后高复发和高转移率是导致治疗失败的主要原因。分子靶向制剂的出现为中晚期肝癌患者带来了曙光。庄磊等[9]通过回顾性研究发现，中晚期肝癌患者术后使用索拉非尼可明显延长中位生存时间，取得较为满意的疗效。但是国外一项Ⅲ期临床试验却发现，索拉非尼在晚期肝癌患者的疾病控制率和总生存期方面获益不明显[10]。一方面与部分患者对索拉非尼反应性较低有关；另一方面由于长期大剂量用药，患者耐受性降低，易产生继发性耐药。因此寻找可预测索拉非尼反应性和耐药性的敏感标志物是提高患者临床获益的关键。

SUN 等[5]发现MT1G 作为一种重要的调节蛋白，有望成为索拉非尼治疗肝细胞癌耐药的新靶点。MT1G 属于MT 家族成员之一，由61～81 个氨基酸序列组成，目前已知在肝脏组织和肾脏组织中的相对表达量最高，但是在其他组织中也有表达。本研究结果表明，MT1G 蛋白在肝细胞癌组织中呈低表达，而且与基因启动子甲基化水平有关。因而笔者推测MT1G基因沉默可能与肝细胞癌的发生有一定关联。ZENG 等[11]通过细胞实验也证实，肝癌细胞HepG2、Hep3B、Bel7402、SMMC7721、MHCC97L、HCC97H中MT1G 基因和蛋白相对表达量均明显降低，上调MT1G基因表达后，可抑制肝癌细胞的增殖活性，其作用机制可能与调节基质金属蛋白酶家族成员及上皮间质转化进程有关，这与TCGA 数据库中提供的数据基本一致。

进一步分析MT1G 蛋白与中晚期肝细胞癌患者临床病理特征的关系，结果表明肝细胞癌组织中MT1G蛋白阳性表达率与Child-Pugh 分级、BCLC 分期、术前血清甲胎蛋白水平有关，笔者推测虽然MT1G基因启动子发生甲基化是发生在细胞癌变的早期阶段，但是MT1G不仅具有类癌基因的活性，属于肿瘤生长抑制因子，还可能与肿瘤的侵袭、转移也有一定的关系。JI 等[12]也曾证实，MT1G基因甲基化水平可作为筛查肝癌高危患者的敏感指标，特异性和敏感性分别为69.0%和83.8%，均高于血清甲胎蛋白的诊断效能，并且Ⅲ、Ⅳ期患者血清MT1G基因甲基化水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者。但是目前关于MT1G 抑制肿瘤细胞侵袭和转移的机制尚不明确，需要进一步深入研究。

2012年，DIXON 等[13]首次提出“铁死亡”的概念，与传统的凋亡概念不同，“铁死亡”是由于细胞内铁依赖性脂质过氧化物积累导致细胞收缩，线粒体膜密度升高，最终引起细胞死亡。YUAN 等[14]证实，沉默CISD1基因的表达，可导致细胞内线粒体大量积累活性氧，进而触发肝细胞癌“铁死亡”程序。2012年，CORIAT 等[15]发现索拉非尼通过诱导肝细胞癌发生氧化应激反应，分泌活性氧，一方面发挥肿瘤细胞杀伤作用；另一方面易导致正常细胞内聚集储存铁，产生毒副作用；而补充铁螯合剂可降低索拉非尼毒副反应的发生率。后来，SUN 等[5]研究证实，上述作用机制与细胞“铁死亡”有关，属于非激酶依赖性途径，另外索拉非尼诱导肝细胞癌铁死亡的机制取决于MT1G基因甲基化状态，上调MT1G基因表达，可增强索拉非尼诱导铁死亡作用，从而提高治疗的反应性。本研究结果也表明，对于肝细胞癌组织MT1G 蛋白阳性表达者，中位生存时间明显缩短，随访3年间总生存率也低于MT1G 蛋白阴性表达者，由于纳入的样本量偏少，最终并未得出统计学差异。

综上所述，MT1G 蛋白在中晚期肝细胞癌组织中表达降低，与MT1G基因启动子过度甲基化有关。而且MT1G 是参与索拉非尼诱导肝细胞癌细胞“铁死亡”过程中的重要分子，MT1G 阳性表达的中晚期肝细胞癌患者接受索拉非尼治疗获益有限，相对阴性表达者预后不良，提示MT1G 有望成为肝细胞癌患者接受索拉非尼治疗的潜在预后指标，以及逆转索拉非尼耐药的重要分子靶点。但是目前关于“铁死亡”的作用机制、索拉非尼与“铁死亡”的关系，以及MT1G 在索拉非尼耐药性中扮演的角色等问题尚不明确，需要更深入的基础性研究以支持本文的结论。