那可丁联合奥沙利铂对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响

翟江云，张斌，郭佳维

（锦州医科大学附属第一医院 1.口腔颌面外科；2.眼科，辽宁 锦州 121000）

人舌鳞状细胞癌是口腔中最常见的上皮源性肿瘤，约占25%～40%[1]。人舌鳞状细胞癌具有明显的侵袭性生物学行为，淋巴结远处转移发生率高，有较高的发病率以及病死率，患者5年生存率＜50%[2-4]。含铂方案的联合化疗是治疗舌癌的重要方法之一，奥沙利铂是第3 代铂类抗肿瘤药物，具有一定程度的细胞毒性[5]。那可丁是一种邻苯二甲酸异喹啉生物碱，源自罂粟，结构与秋水仙碱相似，长期以来被用作人类的咳嗽抑制剂[6]。近年来有研究发现那可丁对各种肿瘤的生长均有抑制作用，且几乎无毒副作用，因此越来越多的人意识到其可作为抗癌药物的潜力[7-8]。目前关于那可丁联合化疗药物作用于人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞的基础研究较少，本实验拟初步探讨那可丁联合奥沙利铂是否对人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞产生协同抑制作用，以期提高化疗对细胞癌的抑制效果，并减轻毒副反应。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞（上海拜力生物科技有限公司），那可丁（北京百奥莱博科技有限公司）浓度：99.9%，溶于二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）。奥沙利铂（江苏恒瑞医药股份有限公司）浓度≥98%，溶于5%葡萄糖溶液。DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶（美国HyClone 有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），青链霉素、DMSO（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8 检测试剂盒（上海弗元生物科技有限公司），Hoechst33342（沈阳万类生物科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（上海贝博生物有限公司），兔抗人Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 多克隆抗体、兔抗人β-actin 单克隆抗体及HRP 标记山羊抗兔IgG（沈阳万类生物科技有限公司）。

1.2 分组

实验分为空白对照组、奥沙利铂组、那可丁组及联合用药组。空白对照组采用DMEM 高糖培养基培养细胞；奥沙利铂组采用终浓度为2μmol/L 奥沙利铂的DMEM 高糖培养基培养细胞[9]；那可丁组采用终浓度为40μmol/L 那可丁的DMEM 高糖培养基培养细胞；联合用药组采用终浓度为2μmol/L 奥沙利铂和40μmol/L 那可丁的DMEM 高糖培养基培养细胞。

1.3 方法

人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞在含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM 高糖培养液中培养，置于37℃、5%二氧化碳恒温培养箱中。当细胞生长密度达到80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化法传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.1 CCK-8 法Tca8113 细胞经胰酶消化法制成单细胞悬液，对细胞进行计数。以5×103个/孔的细胞密度接种至96 孔板，每组分4 个平行孔，设置空白调零孔，每孔100μl，96 孔板的边缘孔加入等量无菌PBS。将96 孔板置于含37℃、5%二氧化碳恒温培养箱中，待细胞贴壁后，分别加入含0、5、10、20、40、60 及80μmol/L 的那可丁培养基，继续培养24 h。每孔加入10μl CCK-8 试剂，放入培养箱孵育1 h，酶标仪在450 nm 波长处测定吸光度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（OD药物组-OD调零组）/（OD空白组-OD调零组）×100%[10]。

1.3.2 Hoechst33342 荧光染色法将Tca8113 细胞以5×104个/孔的细胞密度接种至24 孔板中，每孔1 ml。待细胞贴壁后，按照实验分组加药，处理细胞24 h 后每孔加入200μl Hoechst33342 染色液均匀覆盖皿底，避光染色20 min，PBS 清洗3 遍，置于荧光显微镜下观察细胞形态学变化，并随机拍照记录，实验重复3 次。

1.3.3 流式细胞术取对数生长期的Tca8113 细胞以5×105个/孔的细胞密度接种至6 孔板中，按实验分组处理细胞24 h，胰酶（不含酚红、EDTA）消化，PBS清洗3遍，加入400μl Annexin V结合液重悬细胞，然后加入5μl Annexin V-FITC 混匀后，避光15 min，再加入10μl 碘化丙啶混匀，避光反应5 min，上机检测细胞凋亡率。

1.3.4 Western blotting收集加药处理后的细胞，PBS清洗3 遍，加入细胞裂解液重悬，超声破碎10 s，冰上静置3 min，重复3 次。以4℃、12 000 r/min 离心30 min，提取上清液，测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE电泳2 h，恒流300 mA 转膜90 min，5%脱脂牛奶封闭2 h，按照1 ∶500 稀释并加入一抗（Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 或Cleaved Caspase-3），4℃过夜，室温孵育二抗1 h，洗膜、加超敏ECL 化学发光试剂曝光显影。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度那可丁处理后的Tca8113 细胞存活率比较及最佳药物浓度筛选

0、5、10、20、40、60 及80μmol/L 的那可丁处理后的Tca8113 细胞存活率分别为（100.00±0.00）%、（89.98±0.61）%、（83.83±1.90）%、（72.44±1.19）%、（58.32±1.15）%、（44.47±1.26）%和（40.11±1.68）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=997.488，P=0.000），随着那可丁浓度逐渐增大，细胞存活率逐渐下降。本实验显示，40μmol/L 的那可丁处理Tca8113细胞24 h 后，细胞存活率约58%，选定40μmol/L 做为最佳药物浓度，后续试验均采用此条件。见图1。

2.2 各组Tca8113 细胞存活率比较

图1 不同浓度那可丁处理后Tca8113 细胞存活率变化趋势

空白对照组、奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组的Tca8113 细胞存活率分别为（100.00±0.00）%、（70.17±1.43）%、（59.90±1.19）%和（50.79±1.28）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=716.017，P=0.000）。奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组较空白对照组低（P＜0.05），联合用药组较奥沙利铂组、那可丁组低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组Tca8113 细胞存活率比较 （±s）

2.3 各组Tca8113 细胞凋亡形态

在荧光显微镜下观察到，空白对照组细胞核规整呈圆形或卵圆形，呈均匀淡蓝色荧光。奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组的细胞均可见不规则碎裂、核固缩明显，且比例逐渐增多，高强度亮蓝荧光较空白对照组强，细胞凋亡显著增多。联合用药组较奥沙利铂组和那可丁组凋亡更明显。见图3。

2.4 各组Tca8113 细胞凋亡率比较

空白对照组、奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组的Tca8113 细胞凋亡率分别为（5.27±1.42）%、（17.20±1.20）%、（23.07±3.04）%和（29.30±3.92）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=29.827，P=0.000），奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组较空白对照组高（P＜0.05），联合用药组较奥沙利铂组、那可丁组高（P＜0.05）。这说明联合用药组诱导细胞凋亡更显著。见图4、5。

图3 各组Tca8113 细胞凋亡形态 （×200）

2.5 各组Tca8113 细胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白的相对表达量比较

各组Tca8113 细胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组Bax、PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表达较空白对照组高（P＜0.05），而Bcl-2 的蛋白表达较空白对照组低（P＜0.05），联合用药组Bax、PARP、Cleaved Caspase-9 及Cleaved Caspase-3 的蛋白表达较奥沙利铂组、那可丁组高（P＜0.05），Bcl-2 的蛋白表达较奥沙利铂组、那可丁组低（P＜0.05）。见表1和图6。

图4 各组流式细胞图

图5 各组Tca8113 细胞凋亡率比较 （±s）

表1 各组Tca8113细胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白的相对表达量比较 （±s）

表1 各组Tca8113细胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白的相对表达量比较 （±s）

组别 PARP Cleaved Caspase-9 Bcl-2 Bax Cleaved Caspase-3空白对照组 0.702±0.049 0.672±0.042 1.353±0.061 0.799±0.012 0.687±0.059奥沙利铂组 1.118±0.135 1.086±0.116 1.076±0.047 1.247±0.045 1.043±0.100那可丁组 1.214±0.086 1.274±0.130 0.879±0.019 1.579±0.049 1.266±0.211联合用药组 1.521±0.084 1.642±0.114 0.750±0.043 1.870±0.022 1.706±0.155 F 值 26.017 28.792 67.144 336.520 17.716 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001

图6 各组Tca-8113 细胞Bax、Bcl-2、PARP、Cleaved Caspase-9 和Cleaved Caspase-3 蛋白的相对表达量比较

3 讨论

那可丁作为镇咳药被广泛研究。近年来发现其结构与秋水仙碱相似，发现其在抗肿瘤活性筛选过程中通过抑制微管蛋白具有一定的抗肿瘤活性[11]。有研究表明，那可丁通过与微管蛋白结合促进微管聚合，在有丝分裂过程中诱导肿瘤细胞生长停滞，从而发挥抗肿瘤作用[12]。TIAN 等[12]指出，与常用的化疗药物相比，那可丁没有表现出严重的毒副作用，是一种安全的抗肿瘤药物。有研究表明那可丁对多种癌细胞均有很强的抑制作用[13-14]。XU 等[15]研究发现，那可丁抑制肝癌HepG2 和Huh7 细胞的活性具有剂量和时间依赖性，在小鼠异种移植模型中，能在不影响小鼠体重的前提下，显现出对肝癌的抑制作用。但关于那可丁联合奥沙利铂诱导人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞凋亡的研究目前鲜有报道。本研究CCK-8 实验结果显示，与空白对照组、奥沙利铂组和那可丁组相比，联合用药组细胞存活率更低；流式细胞术结果显示，联合用药组细胞凋亡率明显升高并且高于那可丁组与奥沙利铂组，表明那可丁联合奥沙利铂有协同抗肿瘤作用。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，是通过内源性（线粒体介导）与外源性两种独立的通路调控[16]。有研究表明，线粒体介导的内源性通路与Bax、Bcl-2、Caspase-9 和Caspase-3 等蛋白密切相关[17-18]。本研究通过检测内源性通路的相关蛋白表达，进一步探究那可丁联合奥沙利铂可协同抑制人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞的生长。Bcl-2 家族成员对调节线粒体信号通路中细胞色素C 的释放起着关键作用[19]。抗凋亡蛋白Bcl-2 通过抑制细胞色素C 从线粒体释放到胞浆中来阻断细胞凋亡，而促凋亡蛋白Bax 通过破坏线粒体膜的完整性来诱导细胞凋亡[20]。有研究表明，一旦细胞色素C 释放到线粒体外膜，关键的凋亡执行因子Caspase-3 被凋亡激活因子Caspase-9 激活，随后触发PARP 的裂解，PARP 主要参与DNA 修复，对不同的凋亡信号刺激作出不同反应，并成为凋亡细胞的标志物[21]。郝亚伟等[10]研究发现那可丁联合顺铂作用于人骨肉瘤MG-63 细胞系后，导致Bcl-2/Bax 的表达失衡，通过内源性通路，激活Caspase 级联反应，促使细胞凋亡。本研究实验结果显示，奥沙利铂组、那可丁组和联合用药组Bcl-2 蛋白表达较空白对照组下调，同时PARP、Caspase-9、Caspase-3 及Bax 蛋白表达较空白对照组上调，且联合用药组效果优于单独奥沙利铂组与那可丁组，这提示那可丁联合奥沙利铂对诱导人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞的凋亡具有协同作用。笔者推测那可丁联合奥沙利铂可能通过线粒体介导的内源性通路诱导人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞凋亡。

综上所述，本研究表明那可丁联合奥沙利铂可能通过内源性的线粒体途径诱导人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞凋亡，且那可丁联合奥沙利铂对Tca8113细胞的生长具有协同抑制作用。当两者联合应用时，降低了化疗药物所占的给药比例，减少了毒副作用，并增强了对肿瘤细胞的抑制作用。