Glypican-1在脑胶质瘤中的表达及与临床病理特征和预后的关系*

贾国萍，李鑫，宋雨茜，宋涛，王珊

（1.中南大学化学化工学院 制药工程系，湖南 长沙 410038；2.中南大学湘雅医院神经外科，湖南 长沙 410008）

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的50%以上，具有起病隐匿、恶性程度高等特点[1]。目前治疗方式以手术切除联合放化疗为主。由于脑胶质瘤细胞呈弥漫性浸润且中枢神经系统比较脆弱，所以患者预后较差，术后易复发，生存期短[2]。全球每年约有18.9 万新发病例，其中14.2 万例死亡，严重影响了人类健康[3-5]。因此，急需寻找脑胶质瘤早期诊断及预后评估的有效分子靶标，为脑胶质瘤的诊断及治疗提供理论依据。

Glypican-1 在人脑胶质瘤组织中高表达，具有促进胶质瘤细胞增殖的能力[6]。一项包含53 例脑胶质瘤患者的临床研究结果表明，脑胶质瘤组织中Glypican-1 的表达与患者总生存期相关[7]，提示Glypican-1 可能是脑胶质瘤预后的重要评价指标。然而，另一项包含31 例脑胶质瘤患者的临床研究结果表明，Glypican-1 的表达与临床病理特征（包括总生存期和肿瘤分级）无关[8]。因此，只关注Glypican-1在脑胶质瘤组织的总体表达水平可能不足以准确地评价脑胶质瘤患者的预后。除了蛋白的总体表达水平，蛋白的分布规律对评估疾病的预后亦有一定的指导意义。鉴于Glypican-1 可以在细胞膜及细胞质表达，本研究收集171 例脑胶质瘤患者的组织芯片，检测Glypican-1 在脑胶质瘤细胞质和细胞膜中的表达，并探讨其与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

人脑胶质瘤组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司，共171 例脑胶质瘤组织。其中，男性108 例，女性63 例；年龄2～80 岁。所有标本按世界卫生组织（WHO）（2007）神经上皮肿瘤分级标准[9]进行分级：Ⅰ级20 例，Ⅱ级79 例，Ⅲ级51 例，Ⅳ级21 例。

Glypican-1 兔多克隆抗体购自美国Proteintech公司（货号：16700-1-AP），免疫组织化学试剂盒和DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，苏木精购自美国Sigma 公司。

1.2 方法

采用免疫组织化学法检测Glypican-1 的表达。脑胶质瘤组织芯片经二甲苯、梯度乙醇依次浸泡、脱蜡。在柠檬酸盐抗原修复液中高压修复，经PBS 缓冲液清洗后，加入1 ∶50 稀释的兔抗Glypican-1 抗体4℃孵育过夜。玻片室温下复温＞30 min，经PBS 缓冲液冲洗后滴加二抗，室温孵育30 min。使用DAB试剂盒显色，冲洗后苏木精复染，盐酸乙醇分化，自来水冲洗，室温晾干后用中性树胶封片。

结果的判读采用双盲法。聘请2 位病理学专家对组织芯片的免疫组织化学结果进行评分。①根据细胞染色强度进行评分：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分；②根据细胞染色阳性率进行评分：0%为0 分，＞0%～25%为1 分，＞25%～50% 为2 分，＞50%～75% 为3 分，＞75%～100%为4 分；最终总评分为染色强度评分与染色阳性率评分的乘积[10]。总评分≤3 分为Glypican-1低表达，总评分＞3 分为Glypican-1 高表达。

1.3 随访

随访期限为手术时间（2008年2月—2011年10月）至2017年7月，每3 个月电话随访1 次，随访时间为6.0～9.4年，以患者死亡为终点。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验；影响因素的分析采用Cox 比例风险回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Glypican-1 在脑胶质瘤组织中的表达

免疫组织化学染色结果显示，Glypican-1 在脑胶质瘤细胞质及细胞膜中均有表达，且Glypican-1 在脑胶质瘤细胞膜的黄染程度及范围随患者肿瘤分级升高而加深或扩大。见图1。

2.2 不同临床病理特征患者脑胶质瘤细胞Glypican-1 的表达

图1 Glypican-1 在不同肿瘤分级患者脑胶质瘤组织中的表达 （免疫组织化学染色）

不同年龄患者脑胶质瘤细胞质Glypican-1 高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），＞50 岁患者较高；不同性别、肿瘤分级患者脑胶质瘤细胞质Glypican-1 高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

不同肿瘤分级患者脑胶质瘤细胞膜Glypican-1高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ级患者较高；不同性别、年龄患者脑胶质瘤细胞膜Glypican-1 高表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征患者脑胶质瘤细胞质及细胞膜Glypican-1 高表达率比较 例（%）

2.3 Glypican-1 与脑胶质瘤患者预后的关系

不同性别患者的总生存期比较，经Log-rank χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同年龄、肿瘤分级患者的总生存期比较，差异有统计学意义（P＜0.05），＞50 岁和Ⅲ、Ⅳ级患者总生存期较短。不同脑胶质瘤细胞质Glypican-1 表达水平患者的总生存期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同脑胶质瘤细胞膜Glypican-1 表达水平患者的总生存期比较，差异有统计学意义（P＜0.05），脑胶质瘤细胞膜Glypican-1 表达水平越高，患者总生存期越短。见表2和图2。

以是否死亡为因变量，以其他参数为自变量，其中女性、年龄＞50 岁、肿瘤分级Ⅲ和Ⅳ级、脑胶质瘤细胞质Glypican-1 高表达、脑胶质瘤细胞膜Glypican-1 高表达赋值为1。逐步多因素Cox 回归分析结果显示，年龄＞50 岁、肿瘤分级Ⅲ和Ⅳ级、Glypican-1 在脑胶质瘤细胞膜中高表达是患者预后的影响因素（P＜0.05）。见表3。

表2 影响脑胶质瘤患者预后的单因素分析

图2 脑胶质瘤细胞质和细胞膜不同Glypican-1 表达水平患者的生存曲线

表3 影响胶质瘤患者预后的多因素分析参数

3 讨论

GPCs 是HSPG 家族的一员，通过GPI 锚定附着于细胞膜表面[11]。GPCs 家族包括6 位成员（Glypican-1～Glypican-6）[12]。其 中Glypican-1 定 位 于 染 色体2q36，邻 近COL4A3/4[13]。Glypican-1 在 胰 腺 癌、乳腺癌及食管鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中高表达[14-17]，其表达水平与多种癌症的预后相关[15-17]，且Glypican-1 能促进肿瘤细胞增殖、转移、侵袭及血管生成[15-19]，综上所述，Glypican-1 可能在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。

研究表明，Glypican-1 在脑胶质瘤细胞系U251及脑胶质瘤组织中呈高表达[8]。SAITO 等[7]发现经放疗及替莫唑胺治疗后，脑胶质瘤患者Glypican-1 表达水平与总生存期有相关性，但该研究未对Glypican-1表达水平与脑胶质瘤肿瘤分级的相关性进行探讨。笔者首次研究了Glypican-1 在脑胶质瘤细胞膜及细胞质中的表达，并分析其与临床病理特征及预后的关系。结果发现，脑胶质瘤细胞膜Glypican-1 表达水平与肿瘤分级有关，且细胞膜Glypican-1 表达水平越高，患者预后越差，提示检测Glypican-1 在脑胶质瘤细胞膜中的表达水平可能比检测Glypican-1 在脑胶质瘤细胞的总体表达水平更具有临床意义。此外，本研究选取组织芯片进行研究，在同等条件下检测Glypican-1的表达及分布，降低了实验误差；且该组织芯片包括171 例脑胶质瘤患者的标本，并对上述患者进行6.0～9.4年的随访。因此，本研究具有样本量大、随访时间长、实验误差小的优势，所得结论具有一定的说服力，将为脑胶质瘤的临床诊断及预后判断提供理论依据。