基于基因芯片研究中医药治疗类风湿关节炎的进展

孙珍珍 郭锦晨 刘健

【摘 要】 类风湿关节炎以关节滑膜炎、血管翳形成为主要病理表现，致残率高，治愈率低。近年来，随着医药技术的进步，基因芯片的应用更加广泛，通过应用基因芯片技术，可对类风湿关节炎的发病机制、治疗靶点及证候基因组学进行研究，并从基因水平探究分子机制，为临床提供更为有效的治疗策略，也为类风湿关节炎的后续治疗及深化研究提供科学的理论依据。

【关键词】 关节炎，类风湿;基因芯片;研究进展;综述

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节炎性病变为主的致残性、多发性自身免疫性疾病，主要以关节滑膜炎、血管翳形成为特征，并出现软骨和骨破坏，最终导致关节畸形或残疾，严重影响患者的生活质量。RA的发病机制复杂，是多种因素共同作用的结果。多种信号转导通路、微RNA（miRNA）及细胞因子在RA发病和病情活动过程中发挥作用。此外，现代研究发现，细胞凋亡在RA的发病过程中也占据重要地位[1]，RA的基因表达研究已成为近年来研究领域的一大重点。

基因芯片作为一种基因筛选技术，又称DNA微阵列，属于分子生物学领域的技术之一，具有高通量、高速度、高集成、自动化等优点[2]。近年来，随着医药技术的进步，基因芯片的应用更为广泛。通过应用基因芯片技术，可对RA的发病机制、治疗靶点和证候基因组学进行研究，并从基因水平上探究分子机制，为临床提供更为有效的治疗策略。现就基因芯片用于中医药治疗RA的研究进展予以综述。

1 基因与RA发病

RA是一种全身性自身免疫性疾病，遗传、基因表达异常和滑膜炎症在疾病发展过程中扮演着重要角色[3]。早期诊断和治疗可提高患者的生活质量，改善预后。但由于RA的发病机制和生物标志物尚不明确，早期诊断也难以实现，因此进一步了解其发病机制是当前RA研究领域的一个难题[4]。

目前，对于与RA发病机制相关的滑膜中基因、细胞和蛋白质表达的机制尚不清楚。童也等[5]借助基因芯片表达谱的综合分析方法从RA患者滑膜液巨噬细胞中找出489个差异表达基因（DEGs），确定了STAT1、FPR2、CCL5、OASL等10个核心基因，经研究发现，与正常人相比，RA患者STAT1、PPBP、OASL的基因表达上调，而表达下调的基因有ITGAM、IRF7、CCL5、IRF1。其中DEGs中，CXCL13上调最显著，提示其可能对RA巨噬细胞的聚集和疾病的进展起到关键作用。此外，有研究发现，CXCL13协同CCL20可能会促进RA患者炎症性滑膜中B淋巴细胞迁移和募集[6]。张宇等[7]认为，RA关节损伤和畸变与成纤维样滑膜细胞（FLS）的异常增生有关，通过基因表达谱芯片和定量PCR实验得出TNFSF15、VEGFA、TAC1、WISP3基因在RA患者FLS中表达失调，这些表达异常的基因可能参与了RA的发生、发展。其中VEGF已被研究证实在RA中参与低氧诱导因子信号通路，促进内皮细胞迁移增殖、提高血管通透性[8]。而VEGFA在RA患者FLS中大量表达，对滑膜血管翳形成有特异作用[9]。CAI等[10]基于基因芯片技术研究RA的潜在发病机制，发现CCR4、CXCR4、CCR7、CCL5和CCR5可能是发病的关键基因。ZHENG等[11]采用基因芯片技术对CircRNA表达谱进行分析，发现RA样本中表达上调的CircRNA有255个，下调的有329个，预测CircRNAs可能与RA发生、发展的关键基因表达有关。丁晓等[12]借助GEO数据库中RA滑膜组织基因芯片表达谱，通过生物信息学方法筛选出605个DEGs和MYC、FN1、EGFR、PTPRC、CD86等10种核心基因。有研究发现，PTPRC参与了RA的发病过程，其表达上调可促进滑膜正常功能的发挥;FN1在RA患者血液中表达上调，可为临床诊断提供参考;EGFR在滑膜炎症、破骨细胞形成过程中发挥重要作用，其中破骨细胞会破坏RA关节[13-14]。上述核心基因的发现将有利于进一步阐明RA发病机制。岳龙涛等[15]通过将RA与骨关节炎（osteoarthritis，OA）、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者关节滑膜组织的基因表达谱进行比较，得出RA患者的滑膜组织中ISG20、CD38、IL2RG、E2F2、CFDP1、CD7、ANKRD38基因表达异常，并通过实时定量PCR证实RA患者滑膜组织中IL2RG、CD38、E2F2基因表达上调。研究表明，E2F2在RA患者滑膜中高表达会导致FLS增生，而CD38+B淋巴细胞也被证实参与RA的发病过程[16]。同时，他们还通过比较RA、OA、AS基因芯片表达谱各自的特征，探求RA的发病机制。

RA属中医学“痹证”范畴，发病与内外因有关，内因是正气不足，气血虚弱，外因为风、寒、湿等外邪侵袭。西医学认为，RA的发病机制尚未有定论，可借助基因芯片技术识别筛选其发生、发展的关键基因，提高对RA潜在机制的了解，为其发病机制的进一步研究提供可能的参考依据。同时可以尽早实现早期诊断，找到潜在的治疗靶点，制定更为有效的治疗策略，改善患者的生活质量。

2 药物治疗RA的机制

有专家提出，中医药的优势是以调节基因表达与基因产物的功能为基础进行疾病或证候的治疗。相对于西药而言，中药具有所含化学成分多样，治疗时多靶点、多通路、双向性、多系统的特点，使中药的复杂作用机制难以用现代生物医学方法解释。而基因芯片技术通过识别药物对应的靶序列，分析药物在机体基因组层面上的作用，监测机体在治疗过程中基因的表达变化，从而对疗效进行评定[17]。除此之外，还可借助基因芯片技术于基因层面将中药与西医学联系起来，使中药能够更好地调节基因表达，阐释作用机制，实现中药的现代化。

现阶段国内外多借助基因芯片高集成、多参数的特点对中药进行深入而系统的研究，同时能够建立中药不同成分、不同配伍与药理作用之间的联系。如LYU等[18]设置空白组与模型组，通过芯片分析的方法对粗壮牡丹提取物（CRME）的抗RA作用机制进行分析，CRME组上调基因218个、下调基因191个。同时发现，CRME对与RA有关的趋化因子、组蛋白家族、炎性因子及其配体具有调节作用。刘佳等[19]借助基因芯片技术探索新雷公藤衍生物雷藤舒（LLDT-8）对RA患者FLS相关基因及通路的影响，结果显示，经LLDT-8干预后RA患者FLS中发现408个DEGs，并且其通过对细胞因子受体通路、趋化因子信号转导通路的双向调节，下调肿瘤坏死因子（TNF）、Toll样受体、核转录因子-κB（NF-κB）等信号通路，达到抑制炎症反应的作用，为临床进一步运用雷公藤及中药复方提供实验依据。张英等[20]设置观察组与对照组以探究雷公藤多苷治疗RA对患者外周血单个核细胞（PBMC）中miR-146a基因表达的变化，发现在治疗过程中患者miR-146a表达水平上调，RA患者的临床应答可能与其基线期表达水平升高有关。此外，有研究显示，RA患者体内的TNF-α持续表达与miR-146a功能缺陷密切相关，miR-146a还可通过IRAK1的表达下调抑制FLS增殖及炎性细胞因子的分泌，从而发挥抑制炎症反应的作用[21]。基因芯片技术不仅用于研究基因对不同药物多效性的影响，研究中药作用靶点，还可对中药复方的多靶点效应进行阐释[22]，为中药配伍提供科学依据，指导用药。黄艳等[23]利用基因芯片技术研究清络通痹颗粒（由生地黄、青风藤、桑寄生等组成）对RA患者FLS基因表达的影响，发现清络通痹颗粒对该细胞的凋亡通路有影响，并出现CASP8、BCL2L11、BID等基因的表达上调，促进细胞的凋亡，从而抑制FLS的异常增殖。此外，清络通痹颗粒还可诱导FLS的基因发生差异表达，DEGs涉及到炎症、血管生成、细胞凋亡、免疫调节等方面。邰灣等[24]通过对黑骨藤追风活络胶囊（由黑骨藤、追风伞、青风藤组成）的生物信息学分析，发现455个DEGs，其中包括该药干预RA滑膜的5个活跃基因PRKCB、CDK1、STAT1、RAC2、MAPK1;而5个基因中的STAT1、MAPK1相关的信号通路明显作用于RA滑膜细胞的增殖、迁徙，释放炎症介质等方面，其中STAT1-ERKs相关通路是关键，预测是该药物抗RA潜在作用方向。以上线索有助于该药物针对RA滑膜组织的治疗效应靶基因的深入探索，揭示了黑骨藤追风活络胶囊抗RA的潜在机制，为进一步科学研究指明了方向。

中药复方是在中医理论指导下使用的，为了更加明晰中药复方对疾病的干预机制，必须标准化、规范化中医辨证理论与中药复方的量效关系[25]。基因芯片具有的高通量、高集成特点使其表现出微观的特征，这与中医整体观念相互补充，通过对上万个基因信息筛选分析，从中获取有效数据，于基因层面上为药物作用机制提供科学依据，有效解决阐释中药作用机制的问题，也为中药及中药复方治疗RA药理作用机制的研究提供了新思路。

3 RA证候基因组学

中医强调整体观念、辨证论治，其诊疗模式主要为病证结合，在实现证候规范化的过程中扮演着重要角色。而证候研究的实质是为了阐释中医理论，将中医学与西医学联系起来，证候是理论指导临床的关键，此举将推动中医学与临床的进步。目前对RA的研究尚未采取统一的辨证分型标准，其分型多受医家经验化、主观化影响，在一定程度上限制了中医辨证论治的发展。因此，应利用基因芯片高效性、多参数的优势介入中医证候研究，对人类的表达基因进行扫描分析，筛选有效数据，将有助于进一步用现代医学阐释中医证候，同时也为中医辨证提供客观依据。

根据研究资料显示，基因出现任何异常的突变、重排、缺失、扩增、功能异常或表达异常都会导致疾病的发生、发展，而特异疾病的证候也与基因密切相关[26]。随着现代医药技术的进步，基因芯片技术也开始逐步应用于RA的证候分析。王舒婷[27]研究发现，老年RA热痹组比寒痹组的红细胞沉降率、C-反应蛋白、中医症状积分高。借助基因芯片技术将老年RA组与膝骨关节炎组比较，结果发现，老年RA组基因表达有花生四烯酸代谢等类似于肿瘤组织的特性，能量代谢也与RA发病有较高的相关性。老年RA寒、热证型之间存在少量差异表达的IncRNA和mRNA，其中IncRNA也被研究证明在RA的发生、发展中发挥着重要作用[28-29]。该研究分析了老年RA和膝骨关节炎患者、老年RA寒热痹证型膝关节软骨差异IncRNA和mRNA之间的联系和相关性，为老年RA内在机制进一步探索提供了方向，为后续研究提供了思路。汪洋[30]基于中医从脾论治RA的治则，借助基因芯片表达谱研究脾虚证RA患者的生物特性，发现其差异基因多与水液代谢、免疫应答、蛋白质代谢、细胞生长等生理过程有关。其中CD27表达上调与难治性RA浆细胞升高活化相关;CES1表达下调可能是脾虚证RA患者病情迁延不愈，导致药毒蓄积于肝脏、血浆内;AOP4主要与水的运输有关，其表达异常会引起机体水平衡的紊乱。由上述主要差异基因的功能分析可发现，中医所言“脾主运化”“脾主湿”都有其相对应的基因层面基础。罗十之[31]通过研究FcγRⅡB基因多态性与肾虚型RA之间的关系，设置肾虚组与非肾虚组，发现两者FcγRⅡB基因多态性695TC与695TT，OR值为12.136，差异有统计学意义（P < 0.05）。肾虚型RA与FcγRⅡB 695TC密切相关，推测FcγRⅡB 695TC的RA患者中肾虚型多可能与先天失养、肾精不足有关，该结果为肾虚型RA病因病机的免疫学机制提供了科学依据。此外，有学者通过基因芯片技术研究分析活动期与稳定期、寒证与热证、早期与非早期RA患者外周血CD4+T淋巴细胞之间的基因表达差异，已有研究证实RA的发生、发展与CD4+T淋巴细胞有关[32]。研究结果发现，RA寒热证候间的基因表达谱存在差异，这种差异与RA患者稳定期和活动期、RA患者和正常人之间的基因表达都不同，提示可以利用基因芯片技术研究RA患者基因表达图谱。HAAS等[33]借助基因芯片分析11对双胞胎（每对双胞胎中一人是RA患者）中RA患者与非RA患者B淋巴细胞的基因表达差异，在发现的DEGs中显著表达上调的有CYR61、HSD11B2和FLJ90650，表达下调的有MYO1B和IRF7等。这些表达差异显著的基因可能作为RA的标志基因。在排除其他客观因素的条件下，分析、寻找RA患者与其双胞胎或亲属之间的特异DEGs，再将这些DEGs按证候进行聚类分析，使得每一证候特异的DEGs组更为准确，有利于建立完整的RA基因表达图谱。

以上研究初步证实了不同证候的RA患者具有不同的基因表达，说明可以利用基因芯片技术研究RA患者基因表达图谱。基因芯片技术凭借其优势从基因微观水平研究中医辨证分型，逐步建立微观辨证，与中医宏观辨证相互补充，大大提高了对RA证候的本质认识，为建立RA证型基因表达谱奠定基础[34]。随着现代生物理化技术的发展，对于RA证候的研究逐渐发展到分子水平、基因水平，利用基因芯片介入中医证候研究，有助于为中医辨证提供客观依据，更有效地防治RA。

4 结 语

基因芯片作为一种基因筛选技术，近年来在医学领域应用广泛。其凭借高度平行性、高集成等优点，在探究RA的发病机制、药物治疗RA机制以及RA证候基因组学研究中发挥了重要作用，在西医学与中医学之间架起了一座桥梁，为临床治疗RA提供了思路和依据。但目前基因芯片技术仍存在成本较高、基因型有限、临床开展较困难等缺点。相信随着现代医药技术的进步，未来基因芯片技术会以快速、准确且低成本的新优势得以普遍应用，不仅在促进中医药防治RA方面取得突破性进展，也会为中医基因组学研究开辟新的路径。

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收稿日期：2020-03-26;修回日期：2020-06-22