雷公藤多苷对胶原诱导性关节炎大鼠下丘脑视交叉上核Bmal1、Clock表达的调节作用

王少贤 李振彬

【摘 要】目的：觀察胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠下丘脑视交叉上核（SCN）生物钟基因Bmal1、Clock的表达变化，以及雷公藤多苷的调节作用。方法：建立CIA大鼠模型，随机分为模型对照组、醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组，并设空白对照组，每组8只。醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组分别于20：00灌胃给药，雷公藤多苷用药量10.5 mg·kg-1·d-1，醋酸泼尼松片用药量1.5 mg·kg-1·d-1;空白对照组、模型对照组灌服生理盐水。连续给药6周。观测各组大鼠足爪、关节肿胀情况，ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6水平，qRT-PCR和Western-blot法检测SCN Bmal1、Clock基因和蛋白表达。结果：①实验结束，与空白对照组比较，CIA模型大鼠左后踝关节围长、足跖厚度、足趾容积、关节炎指数（AI）评分均明显增加（P < 0.05），血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高（P < 0.05），下丘脑SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表达均明显下降（P < 0.05）。②与模型对照组比较，醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组均能明显改善大鼠足爪、关节肿胀程度，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表达（P < 0.05），雷公藤多苷组对SCN Bmal1表达的调节作用优于醋酸泼尼松组（P < 0.05）。结论：关节炎的发病影响了血清炎性细胞因子和下丘脑SCN生物钟的表达;雷公藤多苷治疗CIA模型大鼠关节炎症的作用机制与调控下丘脑SCN核心钟基因表达和外周炎性细胞因子分泌水平相关。

【关键词】 胶原诱导性关节炎;雷公藤多苷;下丘脑视交叉上核;生物钟;Bmal1;Clock;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the expression of CLOCK and Bmall in suprachiasmatic nucleus（SCN）of hypothalamus in collagen induced arthritis（CIA）rats and the regulation of Tripterygium.Methods：The rat model of collagen induced arthritis was established and randomly divided into a model control group，a prednisone acetate group and a tripterygium glycosides group.There was a blank control group.There were 8 rats in each group.The prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group were given intragastric administration at 20：00，respectively with dosage of 1.5 mg·kg-1·d-1 and 10.5 mg·kg-1·d-1，once a day.The blank control group and the model control group were given normal saline successively for 6 weeks.The paw and joint swelling of rats in each group were observed.ELISA was used to detected the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6.The gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN were detected by qRT-PCR and Western-blot.Results：①At the end of the experiment，the left posterior ankle joint circumference，plantar thickness，toe volume，arthritis index（AI）scores of CIA model rats were significantly increased compared with the blank control group（P < 0.05）.Levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 were significantly increased（P < 0.05），and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN significantly decreased（P < 0.05）.②Compared with the model control group，the swelling degree of joint and paw could be significantly improved，the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 decreased and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN increased in the prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group.The regulatory effect of in the tripterygium glycosides group on Bmall expression in SCN was better than that in the prednisone acetate group（P < 0.05）.Conclusion：The pathogenesis of arthritis affects the expression of serum inflammatory cytokines and hypothalamic SCN circadian clock;the mechanism of Tripterygium wilfordii polyglycoside in treating CIA model rats is related to the regulation of hypothalamic SCN core clock gene expression and peripheral inflammatory cytokine secretion level.

【Keywords】 collagen induced arthritis;tripterygium glycosides;suprachiasmatic nucleus of hypothalamus;biological clock;Bmall;Clock;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）为慢性全身性免疫性疾病，其主要临床表现如关节僵硬、疼痛、肿胀等晨起明显，具有明显的昼夜节律特点;与RA相关的多种炎症因子[白细胞介素（IL）-1β、IL-6等]及抗炎因子（Cotisol）也呈现明显的昼夜变化[1-4]。研究发现，这种节律变化与生物钟基因表达变化密切相关[5-7]。

本研究拟观察雷公藤多苷对胶原诱导关节炎（CIA）大鼠下丘脑视交叉上核（SCN）生物钟基因Clock、Bmal1的表达，以及模型大鼠关节炎症和外周血炎性细胞因子的变化，旨在从生物钟基因角度探讨雷公藤多苷治疗RA的新机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠60只，6～7周龄，雄性，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK（京）2016-0011。清洁级动物房饲养，室温（21±1）℃，相对湿度40%～60%，固定光照明、暗各12 h（明7：00～19：00，暗19：00～7：00），自由摄食、饮水。本实验通过中国人民解放军白求恩国际和平医院医学伦理委员会批准，在实验过程中尽可能减少动物的痛苦和死亡。

1.2 药 物 雷公藤多苷（纯度98%，南京泽郎生物科技有限公司，生产批号ZL170225-LGTDG）;醋酸泼尼松片（辰欣药业股份有限公司，生产批号160813201）;雷公藤多苷和醋酸泼尼松片均以质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠溶解灌胃给药。

1.3 主要试剂和仪器 弗氏完全佐剂（美国Sigma-Aldrich公司，货号F-5881）;牛Ⅱ型胶原（美国Chondrex公司，货号20022）;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6 ELISA kit（德国IBL International GmbH公司，货号分别为BE45471、BE45411、BE45361）;TRNzol Universal总RNA提取试剂、M-MLV反转录试剂盒、FastFire快速荧光定量PCR预混试剂（SYBR Green）、BCA蛋白质定量试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号分别为DP424、KR118、FP207、PA115];RIPA Buffer（美国Thermo Fisher Scientific公司，货號89900）;β-actin小鼠单克隆一抗（英国Abcam公司，货号ab8226）;Clock小鼠单克隆一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-271603）;Bmal1小鼠单克隆一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-373955）;二抗羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记抗体（IgG-HRP，北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZDR-5307）;YLS-7C足趾容积测量仪（山东省医学科学院济南益延科技发展有限公司，3K15型）;低温离心机（德国Sigma公司，ND2000型）;微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）;7300实时荧光定量PCR系统（美国ABI公司）;凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.4 CIA大鼠模型制备与分组 大鼠适应性饲养

1周，根据体质量编号随机分为空白对照组8只，造模组52只。将弗氏完全佐剂与含牛Ⅱ型胶原的0.05 mol·L-1醋酸溶液等体积振荡混匀，充分乳化，最终胶原含量为1 mg·mL-1。于造模组大鼠右后足爪、背部、尾根部皮下多点注射胶原溶液0.2 mL，第15天每只大鼠再次注射胶原溶液0.1 mL，加强免疫。空白对照组大鼠在相同部位注射等体积生理盐水。关节炎指数（AI）评分采用5级评分法评定[8]。0分，关节、足趾无红肿;1分，趾关节红肿;2分，足趾关节和足跖肿胀;3分，踝关节以下足爪肿胀;4分，踝关节和足爪均明显肿胀。每只大鼠单肢评分最高4分，四肢累计得分为AI评分，最高16分。

AI评分≥4分视为造模成功[9]。本次实验模型大鼠首次免疫注射后第21天AI评分≥4分共计30只（占57.69%），随机分为模型对照组、醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组，每组10只。最终每组纳入8只大鼠进行统计分析。

1.5 给药方法 雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组分别于20：00灌胃相应药物，空白对照组、模型对照组灌服生理盐水。按照大鼠与70 kg成人体质量折算系数为7计算大鼠每日用药量，雷公藤多苷组用药量10.5 mg·kg-1·d-1（雷公藤多苷组成人用量1.5 mg·kg-1·d-1），每日1次;醋酸泼尼松片用药量1.5 mg·kg-1·d-1（醋酸泼尼松片成人每日15 mg），每日1次。连续给药6周后取材。

1.6 检测指标

1.6.1 足爪、关节肿胀情况 观察比较实验结束后各组大鼠左后足趾容积、足跖厚度、踝关节围长并评定四肢AI得分，综合评定治疗用药后大鼠足爪和关节肿胀变化程度。左后足爪容积、足跖厚度、踝关节围长测定：采用足趾容积测量仪测量每只大鼠左后足趾容积（mL），游标卡尺测定左后足跖厚度、踝关节围长（mm）。

1.6.2 ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 实验结束，以质量分数为2%的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔麻醉大鼠，断头，取血，离心机在4 ℃以3500 r·min-1离心20 min，离心半径8.2 cm，分离血清，按照试剂盒说明，测定各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.3 qRT-PCR和Western-blot法检测SCN中Bmal1、Clock基因和蛋白表达 取血同时，快速取脑，液氮速冻，抠取SCN组织，进行qRT-PCR和Western-blot检测。

1.6.3.1 qRT-PCR主要步骤 ①总RNA提取：大鼠SCN组织50 μg，加入1 mL TRNzol Universal试剂提取总RNA。②cDNA合成：根据M-MLV反转录试剂盒说明，配置20 μL反应体系：5× FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNA提取液5 μL（含total RNA 1 μg/样本），RNase-Free dd H2O 11 μL。

于PCR仪上，42 ℃ 15 min，然后95 ℃加热3 min灭活反转录酶，逆转录合成cDNA。③PCR扩增：以cDNA为模板，根据试剂盒说明进行荧光定量PCR扩增。50 μL PCR反应体系：2×FastFire qPCR PreMix 25 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，cDNA模板1 μL，ROX Reference Dye 5 μL，去离子水16 μL。DNA模板预变性95 ℃ 1 min，然后PCR反应40个循环：变性95 ℃ 5 s，模板与引物退火58 ℃ 10 s，引物延伸72 ℃ 31 s，于72 ℃引物延伸时采集荧光信号。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β-actin：上游引物（5'至3'）GGTCATCACCATTGGCAA，下游引物（5'至3'）GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA，105 bp。Clock：上游引物（5'至3'）TCGGCAGCAAGAAGAACTAAG，下游引物（5'至3'）AGAACCAAGATTCAGTCCAGG，109 bp。Bmal1：上游引物（5'至3）TGCCACCAACCCATACAC，下游引物（5'至3'）CCTCGGTCACATCCTACGAC，120 bp。β-actin为内参照基因。PCR扩增完毕后，采用SDSV 1.3软件分析获得Ct值，根据RQ = 2-△△Ct计算各样本Clock、Bmal1 mRNA相对表达量（RQ值），其中空白对照组1号样本RQ值被设定为1。各样本RQ值最终纳入统计分析。

1.6.3.2 Western-blot主要步骤 ①提取总蛋白：SCN组织置EP管，加RIPA Buffer 1 mL匀浆，冰浴反应30 min，充分裂解，离心机以8000 r·min-1离心10 min，离心半径8.2 cm，取上清，提取总蛋白，根据BCA蛋白质定量试剂盒说明进行蛋白浓度测定。②电泳、转膜：30 μg  蛋白/样本进行SDS-PAGE电泳，分离目标蛋白条带，然后电泳转膜至PVDF膜。③封闭：转膜完毕，蒸馏水振荡冲洗5 min × 3次，以5%脫脂奶粉室温下封闭60 min。④一抗、二抗孵育：TTBS洗膜5 min×3次，加Clock（1∶300）或Bmal1（1∶300）或β-actin（1∶500）一抗，4 ℃孵育过夜;TTBS洗膜5 min×3次，加入1∶3000羊抗小鼠IgG-HRP，4 ℃孵育60 min。⑤蛋白检测：TTBS室温洗膜10 min×3次，TBS洗膜5 min，化学发光法检测获得目标条带，凝胶成像系统成像。β-actin为参照条带，采用Image-Pro Plus 6.0分析目标条带积分光密度值（IOD），以IOD目标条带/IODβ-actin公式计算Bmal1、Clock蛋白表达相对含量，纳入统计分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐组间比较采用SNK-q法，方差不齐组间比较采用Dunnett's T3法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠足爪、关节肿胀程度比较 实验结束，CIA模型大鼠左后踝关节围长、足跖厚度、足趾容积、四肢AI评分均较空白对照组大鼠明显增加（P < 0.05）;醋酸泼尼松组和雷公藤多苷组大鼠左后足爪各个指标均明显下降（P < 0.05），2组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较 实验结束，ELISA法测得CIA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平较空白对照组大鼠均明显升高（P < 0.05）;醋酸泼尼松组、雷公藤多苷组均可降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;醋酸泼尼松组与雷公藤多苷组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠下丘脑SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表达比较 与空白对照组比较，模型对照组大鼠下丘脑SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表达均明显下降（P < 0.05）;雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组SCN Bmal1、Clock表达较模型对照组均显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;雷公藤多苷组大鼠SCN Bmal1、Clock表达较醋酸泼尼松组均有所增加，且Bmal1表达2组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3和图1。

3 讨 论

自20世纪60年代至今，RA昼夜节律特点和机制受到越来越多学者关注。RA患者临床症状昼轻夜重的规律特征，与体内炎性细胞因子、褪黑素（MLT）、糖皮质激素的昼夜振荡有关[10]。课题组前期研究和相关研究文献均表明，IL-6、TNF-α、IL-1、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）等炎性因子分泌水平在2：00～7：00达到高峰[11-17]，MLT也在凌晨达到高峰[18]，并且MLT会刺激IL-6等促炎细胞因子分泌增加以加重RA病情[19-20];另一方面，内源性糖皮质激素在RA患者机体内分泌严重不足，且在夜间降至最低水平，皮质醇作为体内关键抗炎物质，则在夜间无法抑制持续的免疫炎症反应[21]，导致RA症状夜间加重，晨起关节僵硬不适等表现明显。

除外体内炎性因子和激素水平变化与RA病变密切相关，生物钟也深度参与了RA的病理过程[5，21-25]。在分子水平上，生物钟由高度进化保守的基因控制，包括激活因子（Clock和Bmal1）和抑制因子（Per1/2和Cry1/2）[22]。缺乏生物钟调节的小鼠表现出关节形态异常和对炎症性关节炎的敏感性增加[23-24]，关节炎病理过程中通常在分离的软骨细胞中观察到促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α等）并伴随着钟基因表达中断[25]，提示昼夜节律、炎症和关节炎之间存在密切关系[26]。在原代培养的RA滑膜细胞中，TNF-α可通过双钙依赖途径调节Bmal1表达[27]，TNF-α还可通过D-box结合蛋白在RA滑膜细胞中调控Per2基因的表达[28]，从而参与RA的发病机制。有研究报道，RA患者血样中白细胞Clock基因的表达，可作为预测改善病情抗风湿药物如TNF抑制剂、IL-6抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞抗原4在RA治疗中的疾病活性和疗效的生物标志物[29]。钟基因变化可影响炎性细胞因子的分泌规律和浓度水平，同时炎性细胞因子的异常又可扰乱钟基因的表达，钟基因与炎性细胞因子相互影响，导致关节炎症状加重。

在哺乳动物体内，位于下丘脑前部的SCN是生物钟昼夜节律的起搏点，可通过神经和激素信号通路对外周生物钟进行调节[30]，而Clock和Bmal1为SCN中整个昼夜节律生物钟转录-翻译反馈环路的核心钟基因和原始动力[31-32]。本研究观测到伴随踝关节、足爪的明显肿胀和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，CIA模型大鼠下丘脑SCN中Bmal1、Clock蛋白和基因表达均明显下降，说明关节炎的发病不但促使炎性细胞因子的表达增加，同时也影响了核心钟基因的表达。

雷公藤多苷是从雷公藤根中提取的一种总皂苷，是雷公藤抗炎、免疫调节的主要活性成分[33]。目前，雷公藤多苷在临床已被广泛应用于治疗RA等炎症性疾病，系统评价雷公藤多苷联合改善病情抗风湿药物可明显减轻RA患者关节肿胀程度、疼痛评分和握力、晨僵程度，降低红细胞沉降率和C-反应蛋白水平[34-35]。机制研究表明，雷公藤多苷可通过调节细胞因子、淋巴细胞、酶类、核转录因子-κB的表达，抑制炎性细胞因子分泌和炎症通路的激活，抑制血管生成和诱导滑膜细胞凋亡，保护软骨和基因调控等方面发挥抗RA作用[36-39]。本课题组近年来致力于RA昼夜节律变化及雷公藤多苷药效机制研究，前期观测到雷公藤多苷、来氟米特在炎症上升期择时用药可以更加有效地抑制炎症、减缓病情[11-12]，但其分子机制有待深入研究。

本研究初步观察到雷公藤多苷、醋酸泼尼松在20：00给药均能明显降低CIA大鼠血清炎性细胞因子水平和增加下丘脑SCN钟基因Bmal1、Clock的表达。提示雷公藤多苷临床治疗RA的作用机制，可能与调控SCN核心钟基因表达和外周炎性细胞因子分泌水平相关，但下丘脑CNS核心钟基因与外周关节炎这一“脑-关节轴”之间复杂的相互作用及其机制尚有待进一步研究。

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收稿日期：2020-04-20;修回日期：2020-05-30