表面修饰探针纳升电喷雾质谱脂质组学对大型溞和蚤状溞的快速鉴别

邓洁薇，杨运云，林 里，栾天罡，

（1.广东工业大学生物医药学院,广州510006；2.广东省科学院,广东省测试分析研究所(中国广州分析测试中心),广东省化学危害应急检测技术重点实验室,广东省原位电离质谱分析工程技术中心,广州510070；3.中山大学生命科学学院,有害生物控制与资源利用国家重点实验室和南海生物资源开发与利用协同创新中心,广州510275）

溞属（Daphnia）生物是一类枝角类淡水浮游动物，体长在0.2～5.0 mm之间，生活在沼泽、池塘、湖泊及河流等多种水环境中［1］. 溞属生物属于一类重要的淡水浮游动物，在水生生态系统中起着重要的能量和养分输送作用，常用作生态学、遗传学、进化生物学和环境科学研究的模式生物［2，3］. 大型溞（Daphnia magna）和蚤状溞（Daphnia pulex）是Daphnia的2大类最常见物种，它们的形态特征非常相似，肉眼难以区分. 传统的Daphnia物种鉴定是基于显微镜或电子显微镜的形态学观察，操作简便直观，但需要经验丰富的专家对细微的形态学特征进行识别和鉴定，并且存在细微差异的近缘种或者近似种因形态特征相似而难以鉴别区分［4］. 近年来，基于分子生物学［4，5］和蛋白组学［6，7］的生物鉴定方法得到迅速发展，这对形态特征极其相似的近缘种或近似种等生物的分类起到了积极作用. 然而，这些方法操作繁琐，需要多步骤样品处理，无法实现物种的快速识别和分类. 因此，开发快速、可靠的生物分子鉴定与分类方法具有重要意义.

脂质是生物体的重要活性化学物质，在细胞膜组成、能量储存和信号转导等生物功能中发挥着重要作用［8］. 生物体具有独特的脂类特征，特定的脂类组学信息与生理或病理状态下的各种生物过程有关. 这些分子特征可为深入了解与脂质组成相关的生物学功能以及生物种属鉴定提供重要依据. 质谱（MS）具有灵敏度高、选择性好、特异性好及信息丰富等优点，是进行脂质组学研究的主流技术手段［9～11］. 近年来，常压敞开式质谱技术发展迅速，该技术具有原位、实时、直接、快速和高通量分析的特点，为常压敞开环境条件下的直接生物脂质分析和组学研究提供了重要手段［12，13］. 如，Cooks等［14］利用解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）分析了人脑胶质瘤和脑实质的脂质代谢特征；Vertes 等［15］利用激光烧蚀电喷雾离子化质谱（LAESI-MS）研究了非洲爪蟾卵细胞和胚胎细胞的磷脂组成与差异；Liu等［16］采用常压敞开式声波喷雾离子化质谱（EASI-MS）技术研究了不同生长周期活体藻类细胞中脂质化合物的变化和组成差异；Quyang 等［17］利用液滴微连接表面采样探针质谱（LMJ-SSP-MS）技术分析了大鼠不同组织器官中脂质化合物及双键异构体的分布差异；Abliz等［18］利用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱（AFADESI-MS）研究了原生状态下的肿瘤相关脂质代谢物和代谢酶.

表面修饰探针纳升电喷雾质谱（SCP-nanoESI-MS）是本课题组针对生物微尺度、原位、活体脂质组学分析开发的一种固相微萃取与敞开式纳升电喷雾质谱联用技术，其通过制备对脂质化合物具有高富集能力的微尺度表面修饰探针，实现了小型生物甚至单细胞内的脂质化合物的高效萃取和敞开式纳升电喷雾质谱分析［19～21］.

本文采用SCP-nanoESI-MS 技术，对Daphnia属D. magna和D. pulex个体进行直接、原位、快速质谱分析，建立了2种Daphnia的脂质指纹图谱，并进行了脂质结构鉴定，结合化学计量学方法分析实现了D. magna和D. pulex的区分，为生物物种快速鉴别提供了新的技术手段.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲醇和氯仿（色谱纯，美国Burdick＆Jackson 公司）；二水氯化钙、二水硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾、高锰酸钾、重铬酸钾和氢氧化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化铵（50%甲醇溶液，德国Fluorochem 公司）；壳聚糖（分子量326700）和三聚磷酸钠（美国Sigma-Aldrich公司）；实验用水为美国Mili-Q公司超纯水仪制备的超纯水.

LTQ-Orbitrap Elite 型线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；Sarix X 7T FT-ICR型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（德国Bruker Daltonics公司）；三维移动平台（北京卓立汉光仪器有限公司）；DM IL型倒置显微镜（德国Leica Microsystems 公司）；BG12-94-4-N-20型纳升电喷雾针（美国New Objective公司）.

1.2 表面修饰探针的制备

参照文献［20］方法，采用RS-6065 型显微解剖钨针制作表面修饰探针：先用甲醇/水溶液（体积比1∶1）将显微解剖钨针的表面清洗干净，然后置于含30 g/L 高锰酸钾和15 g/L 重铬酸钾的30%（质量分数）硫酸溶液中，于90 ℃加热回流24 h. 将钨针取出，用超纯水洗涤干净，置于30%（质量分数）的氢氧化钠溶液中，于90 ℃加热回流24 h，使其表面羟基化. 将表面羟基化的钨针浸入50 mL无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，加入2.5 mL 二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化铵，在氮气保护下于120 ℃加热回流反应12 h. 然后，将探针浸入20 mL 壳聚糖溶液（4 mg/mL，溶于2%乙酸）中超声30 min，向体系中继续加入10 mL三聚磷酸钠溶液（0.5 mg/mL）超声1 h. 反应完成后，取出探针，用甲醇冲洗干净，晾干后即得表面修饰探针，置于干净试管中待用.

1.3 Daphnia培养

D. magna购自广州市微生物研究所，D. pulex由宁波大学赠送，二者均为本实验室连续培养三代以上的单克隆品系.D. magna和D. pulex采用静水式培养，于人工淡水（1000 mL 超纯水中加入58.5 mg二水氯化钙、24.7 mg二水硫酸镁、13.0 mg碳酸氢钠和1.2 mg氯化钾，曝气24 h）中培养，培养温度（20±1）℃，光暗比16∶8，每天喂食淡水藻（Scenedesmus subspicatus）2次.

1.4 采 样

使用制备的表面修饰探针进行采样和萃取. 在倒置显微镜观察下，用精密三维操作台控制探针精确地插入到D. magna或D. pulex的腹部进行采样和萃取（Scheme 1），采样深度为50 μm，采样时间为60 s. 采样结束后，将探针从D. magna或D. pulex体内取出，放入纯水中清洗10 s，自然晾干后，待分析.

Scheme 1 Schematic diagram for analysis of D. magna and D. pulex by SCP⁃nanoESI⁃MS

1.5 微萃取探针纳升电喷雾质谱分析

使用微量注射器将1 μL解吸/喷雾溶剂加入到一支纳升电喷雾针的尖端位置. 将萃取后的微尺度表面修饰探针装载到纳升电喷雾针中，使探针的尖端置于解吸/喷雾溶剂中进行脂质化合物的解吸，解吸时间为30 s. 随后，将表面修饰探针与纳升电喷雾针一起安装到三维移动台上，使纳升电喷雾针的尖端对准质谱入口并距离质谱入口5 mm. 施加+3.0 kV高压电场于探针上，诱导解吸/喷雾溶剂产生纳升电喷雾离子化进入质谱进行分析.

质谱分析采用LTQ-Orbitrap-MS（分辨率约为1.2×105）和FT-ICR-MS（4M 记录模式，质量分辨率约2×105）进行. 离子传输管温度300 ℃；鞘气和辅气均为0 arb；质谱记录采用全扫描模式，扫描质量范围为m/z200～1200. 多级质谱分析采用LTQ-Orbitrap-MS的高能碰撞解离（HCD）进行. 仪器控制和数据处理采用Xcalibur 2.2和FT-MS control软件.

1.6 数据处理与分析

将质谱图扣除背景信号和同位素峰，脂质化合物采用精确质量数（质量数误差<0.005 Da）和二级质谱离子碎片信息进行鉴定，并结合脂质标准品和脂质数据库（http：//lipid MAPS.org）进行比对；统计分析采用Microcal Origin 8.0 软件（美国Northampton 公司）；主成分分析采用SIMCA-P 11.5 软件（瑞典Umetrics公司）.

2 结果与讨论

2.1 SCP⁃nanoESI⁃MS分析D.magna和D.pulex的脂质指纹图谱

SCP-nanoESI-MS 分析D. magna和D. pulex的过程如Scheme 1 所示. 实验采用的微尺度表面修饰探针的基体是尖端为1 μm的显微解剖钨探针，经表面羟基化和硅烷化修饰上对脂质化合物具有高选择性和高富集能力的涂层材料，再经离子凝胶化在探针表面进一步修饰上壳聚糖聚合物外层，以提高探针的生物相容性，所获得的微尺度表面修饰探针的尖端直径小于5 μm，非常有利于对单个小型生物微尺度的原位萃取采样［20］. 该探针对复杂生物样品中的长链脂质化合物如磷脂酰胆碱（PC）和甘油三酯（TAG）具有选择性吸附能力，对不同PC的富集能力达100～300倍，且具有良好的生物相容性和抗干扰能力，可重复使用100次以上.

实验采用的D. magna和D. pulex大小为3～5 mm，制备的探针可以实现对单个小型水生生物的原位萃取和采样及脂质组学研究. 本文采用微尺度表面修饰探针从Daphnia体内进行脂质化合物的萃取和富集，然后在常压敞开条件下，通过直接nanoESI-MS分析探针上富集的脂质，并实现脂质种类和结构的鉴定. 前文［20］曾探讨过D. magna不同部位（腹部、头部、背部和尾部）脂质的组成差异，结果表明，D. magna腹部的脂质最丰富，含量也最高，其次是背部、头部及尾部. 因此，本文选择腹部作为采样点.

对D. magna和D. pulex腹部的脂质进行了SCP-nanoESI-MS 分析［图1（A）和（B）］，发现D. magna和D. pulex的脂质指纹图谱非常相似，在m/z700～950 范围内均可观察到丰富的脂质化合物信号，以m/z778.5344，782.5657，804.5511，843.6456，859.6194，873.6917，889.6660，899.7086 和915.6817等高丰度的离子信号为主.

Fig.1 Lipidomic fingerprints of D. magna(A)and D. pulex(B)

对于脂质化合物的鉴定，可通过高分辨质谱的一级精确质量数（绝对误差≤0.005 Da）和脂质数据库进行比对分析来推导可能的分子式，结合二级质谱离子碎片信息鉴定脂质化合物的不饱和度和脂肪酸链组成. 如，质量数为m/z778.5370 的离子，经LIPID MAPS 数据库搜索为C42H78NO8PNa（［PC（34∶3）+Na］+，δ1.64）或C44H77NO8P（［PC（36∶6）+H］+，δ―1.45）. 对该离子进行HCD实验，在获得的二级质谱图中可观察到3 个高丰度的碎片离子（图2）.m/z719.4618 和595.4683 的碎片离子分别对应于N（CH3）3和C2H5PO4的连续丢失，表明存在PC 类磷脂酰胆碱的基团；m/z573.4873 碎片离子与m/z595.4683的质量差为22，对应于在m/z595.4683处的钠离子丢失和氢离子加合，提示m/z778.5370是［PC（34∶3）+Na］+而不是［PC（36∶6）+H］+. 此外，在其二级质谱图中还可以观察到一系列低丰度的碎片离子.m/z478.3284 和500.3137 碎片离子对应于［PC（34∶3）-C（18∶3）］+和［PC（34∶3）-C（16∶0）］+，m/z441.2376和463.2220碎片离子对应于［M+Na-N（CH3）3-FA（18∶3）］+和［M+Na-N（CH3）3-FA（16∶0）］+，m/z239.2367和261.2208碎片离子分别对应为［FA（16∶0）-H2O］+和［FA（18∶3）-H2O］+，均表明该脂质化合物由C（16∶0）和C（18∶3）2 条脂肪链组成，由此可鉴定m/z778.5370 的结构为［PC（16∶0_18∶3）+Na］+.

Fig.2 MS/MS spectrum of m/z 778.5352

D.magna和D.pulex的脂质鉴定结果列于表1，可见，二者的脂质指纹图谱主要包含PC和TAG 2大种类，且多为钠/钾加合物信号，这是由于生物体内含有大量的钠/钾盐，脂质可以以钠/钾加合物的形式稳定存在.此外，D.magna和D.pulex的脂质化合物种类和脂质化合物脂肪链组成的比例存在一定差异：D.magna的脂质以PC（16∶0_16∶1），PC（16∶0_18∶3），PC（18∶2_18∶2），TAG（16∶0_16∶4_18∶3），TAG（16∶0_16∶1_20∶5）和TAG（18∶1_18∶3_18∶3）等为主；D. pulex的脂质以PC（16∶0_16∶1），PC（16∶0_18∶1），PC（18∶2_18∶2），TAG（16∶0_16∶1_18∶3），TAG（16∶0_16∶1_20∶4）和TAG（18∶1_18∶3_18∶3）等为主［图1（A）和（B）］.

Table 1 List of the identified lipids from D.magna and D.pulex using SCP-nanoESI-MS

2.2 D.magna和D.pulex脂质组成特征

由脂质指纹图谱和鉴定结果可知，在D. magna和D. pulex的脂质组成中甘油三酯的丰度很高. 为研究其甘油三酯的组成特征，进一步对20 只D. magna和20 只D. pulex进行了SCP-nanoESI-MS 分析.m/z839.68，841.67，843.68，845.70，847.71，849.73，851.74 和853.77 的碎片离子分别对应不同饱和度从9到2的各个C50甘油三酯［如TAG（50∶9）表示该甘油三酯中3条脂肪链的碳原子总数为50，双键个数为9］，即TAG（50∶9），TAG（50∶8），TAG（50∶7），TAG（50∶6），TAG（50∶5），TAG（50∶4），TAG（50∶3）和TAG（50∶2）.m/z867.67，869.68，871.70，873.71，875.73和877.75的碎片离子分别对应不同饱和度（从9 到4）的各个C52甘油三酯，即TAG（52∶9），TAG（52∶8），TAG（52∶7），TAG（52∶6），TAG（52∶5）和TAG（52∶4）. 由图3可见，D. magna甘油三酯组成比例的不饱和度较高，C50甘油三酯中丰度最高的是不饱和度为7 的TAG（50∶7），C52甘油三酯中丰度最高的是不饱和度为6 的TAG（52∶6）［图3（A）］；而D. pulex 甘油三酯组成的不饱和度比D. magna低，C50甘油三酯中丰度最高的是TAG（50∶4），C52甘油三酯中丰度最高的是TAG（52∶5）［图3（B）］，提示D. magna和D. pulex 脂质组成特征具有一定的规律性.

2.3 D.magna和D.pulex脂质指纹图谱模式识别分析

采用SIMCA-P统计分析软件对D. magna和D. pulex样本进行了主成分分析，以脂质化合物的质谱相对丰度为变量，以D. magna和D. pulex样本为观察对象，原始数据矩阵经标准化处理，再对其进行运算. 主成分个数提取原则为主成分对应的特征值大于1的前m个主成分. 从方差贡献率来看，第一主成分贡献率为48.67%，贡献率最大，包含的信息最多；第二主成分贡献率为20.02%；第三主成分贡献率为11.84%. 前3个主成分的累计贡献率达到80.53%，基本能反映D. magna和D. pulex的基本特征. 分别以第一、第二和第三主成分来建立坐标系，进行投影即可得到所有样本的PCA得分图和载荷图，结果如图4所示. 由图4（A）的PCA得分图可见，D. magna（M1―M20）和D. pulex（P1―P20）的数据点得到了良好区分.D. magna和D. pulex能够明显地分为2大类，代表这2个物种的脂质组成存在着显著差异. 图4（B）为PCA载荷图，图中每个点代表1个脂质化合物. 脂质化合物的系数绝对值在载荷图中得分越高，代表该化合物对样品分类所起的作用越大. 由图4（B）可见，m/z841.63，843.65，873.69和871.68，这4个离子与D. magna分布呈正相关，而m/z847.68，849.69，877.72和875.71这4个离子与D. pulex分布呈正相关，表明这些脂质是区分D. magna和D. pulex的潜在生物标记物.

Fig.4 PCA score plot(A)and loading plot(B)of D. magna and D. pulex

3 结 论

采用SCP-nanoESI-MS技术对Daphnia属D. magna和D. pulex个体进行直接、快速、原位质谱分析和脂质组学研究，建立了2种Daphnia属生物的脂质指纹图谱，并进行了脂质标记物的结构鉴定. 采用该方法获得了大型溞和蚤状溞的脂质指纹图谱，并研究了二者体内的脂质组成特征，结合化学计量学手段实现了二者的快速区分，鉴定了相关的脂质生物标志物. 由此可见，基于SCP-nanoESI-MS的脂质组学方法适用于Daphnia属D. magna和D. pulex的快速识别和鉴定.