近红外光谱用于低温水结构的分析

赵洪涛，孙 岩，郭一畅，蔡文生，邵学广

（南开大学化学学院分析科学研究中心,天津市生物传感与分子识别重点实验室,药物化学生物学国家重点实验室,天津300071）

近年来关于超冷水、界面水和限域水等的结构和性质的研究备受关注. 在超冷条件下，水的四面体结构会迅速增加，导致热力学响应的变化［1］. 也有研究发现，在超冷条件下水会发生相变，两相具有相似的氢键结构但密度不同［2］. 抗冻剂是一类加入到其它液体（通常为水）中以降低其冰点、提高抗冻能力的物质. 由于抗冻剂能降低水的冰点，在生物抗冻、冷冻保存等方面具有广泛的应用. 因此抗冻剂存在下低温水的结构及冰点降低的机理研究引起了相关学者的关注. 如Oh等［3］利用红外光谱研究了二甲基亚砜（DMSO）降低水冰点的机理，结果表明，DMSO与水在共晶点附近相互作用最强，这可能是导致凝固点降低的原因；Gonda等［4］研究了蔗糖和海藻糖对冰晶生长的抑制作用，发现蔗糖和海藻糖会与水通过氢键作用形成团簇结构，从而抑制水分子的扩散，造成冰晶不易成核和生长. 抗冻蛋白是一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物，是广义上的抗冻剂. 抗冻蛋白对水结构的影响及冰点降低的机理已有研究. 如Hudait等［5］研究了黄粉虫抗冻蛋白降低水冰点的机理，发现蛋白上的羟基可通过氢键作用与水结合，减缓水的动力学，从而抑制水结冰. 此外，还有研究认为抗冻糖蛋白会影响周围的水结构，使其动力学发生改变，不易成核结冰，从而使溶液凝固点降低［6］. 因此，抗冻剂与水之间的相互作用以及水在低温下的结构是理解冰点降低的关键因素.

近红外光谱技术被广泛用于研究水的结构，并被认为是研究溶液中氢键的有效方法之一［7］. Maeda等［8］研究了5～85 ℃下水的近红外光谱，利用化学计量学方法提取出了通过氢键作用形成的5种不同的水结构，即含有0，1，2，3和4个氢键的水结构；Gowen等［9］通过近红外光谱研究了不同金属离子对水氢键网络的影响，结果表明，Al3+和Mg2+会增强水分子之间的氢键作用，而Na+和K+会减弱水分子之间形成的氢键强度；Xu等［10］利用近红外光谱考察了尼龙6脱水过程中水结构的变化，发现尼龙6的脱水过程与游离水及含有1或2个氢键的水结构相关.

本课题组利用水的近红外光谱信息和化学计量学方法实现了有机小分子水溶液［11～13］、血清［14］和脯氨酸溶液［15］等混合体系的定量分析；还利用温控近红外光谱技术研究了人血清蛋白对水结构的影响［16］，发现在蛋白结构发生转变时含有3个氢键的水分子结构（S3）具有重要作用；对不同温度下葡萄糖水溶液的近红外光谱进行了分析，发现葡萄糖和水之间的相互作用起到了稳定四面体水结构的作用，使水的结构更加有序［17，18］；研究了不同温度下寡肽水溶液的近红外光谱，得到了3种水结构的信息及其随温度的变化规律，表明寡肽和水之间的相互作用提高了水结构的热稳定性［19］；分别考察了不同温度下卵清蛋白水溶液［20］和聚合物水溶液［21］的近红外光谱，发现具有2个氢键的水结构在相变的过程中起到了维持溶质结构稳定性的作用.

为了理解低温下水的结构及冰点降低的机理，本文采用近红外光谱并结合拉曼光谱和分子动力学模拟等技术对低温下DMSO-水混合物中的水结构进行了研究. 分析了不同含量DMSO-水混合物的近红外光谱和拉曼光谱，分析了不同温度下混合物的近红外光谱.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DMSO（纯度>99.7%）购自艾览（上海）化工科技有限公司；水为自制二次蒸馏水；配制了DMSO摩尔分数分别为0，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%11个DMSO-水混合物，标记为xDMSO-水（x为DMSO摩尔分数）.

Vertex 70型红外光谱仪，德国布鲁克光谱仪器公司，配置了卤素钨灯光源、InGaAs检测器及量程为1 mm的光纤探头；inVia型拉曼光谱仪，英国雷尼绍公司；DFY-5/120型低温恒温反应浴，天津星科科技有限公司.

1.2 光谱测量与计算

1.2.1 近红外光谱 将光纤探头插入待测液中进行测量，光谱扫描范围为12000～4000 cm−1，扫描64次，光谱分辨率为8 cm−1. 样品的温度由低温恒温反应浴控制，控温精度为±0.1 ℃. 以空气为背景，温度测量范围为20～−70 ℃（纯水为20～0 ℃），温度间隔为10 ℃（纯水为5 ℃），每个温度下稳定30 min后进行光谱采集.

1.2.2 拉曼光谱 将待测液吸取到毛细管中进行测量，激发光波长设为532 nm，光谱测量范围为4000～500 cm−1，激光功率为10 mW，曝光时间为1 s，测量温度为20℃.

1.2.3 连续小波变换 连续小波变换（CWT）已广泛用于增强光谱分辨率并扣除背景和噪声［22～25］. 采用Sym4 小波滤波器的CWT 可计算光谱的近似四阶导数，被认为是提高近红外光谱分辨率的有效方法［26］. 使用Sym4滤波器，近红外光谱的计算中尺度系数设为20，拉曼光谱的计算中尺度系数设为10，以获得合适的平滑效果.

1.2.4 分子动力学模拟 采用NAMD2.13 软件［27］对30%DMSO-水混合物进行模拟. 建立了包含610 个DMSO 分子和1234 个水分子的立方盒子. 水分子模型采用TIP3P［28］，力场参数选择CHARMM力场［29，30］. 分别使用朗之万（Langevin）活塞法和Langevin动力学［31］对压力和温度进行控制，压力控制在1.013×105Pa，温度分别为20 和−70 ℃. 分子动力学轨迹通过可视化软件VMD［32］进行分析，通过SHAKE/RATTLE 和SETTLE 算法约束了含氢基团的化学键［33，34］. 每个体系分别进行了100 ns 的平衡模拟，选取最后50 ns进行统计分析. 氢键的判断依据为O―O距离小于0.35 nm且O―H…O的角度大于150°.

2 结果与讨论

2.1 近红外光谱分析

图1给出了不同DMSO-水混合物在20 ℃时的近红外吸收光谱（NIR）. 图中位于6900和5200 cm−1处的2个谱峰分别归属为OH基团伸缩振动的一级倍频和OH基团弯曲及伸缩振动的组合频［8］. 由于水结构的复杂性，6900 cm−1处的宽峰中包含了各种不同结构OH基团的光谱信息，导致谱峰表现为很宽的重叠峰；如图1所示，随着DMSO含量的增加，该峰向低波数方向移动，表明DMSO与水之间存在相互作用并导致水结构发生变化，且随着二者相对含量的不同逐渐变化. 另外，DMSO和水峰的重叠也可能是导致谱峰移动的原因. 但由于谱峰的重叠难以从图1中得到更多的有效信息.

Fig.1 NIR spectra of xDMSO⁃water mixture

Fig.2 Transformed NIR spectra of water(a)and DMSO(b)

为了从近红外光谱中得到更多信息，使用CWT进行了计算，计算中采用了Sym4小波基，因此计算结果相当于光谱的近似四阶导数［26］. 为了便于分析，图2给出了纯水和纯DMSO 的近似四阶导数近红外光谱，可以看出光谱的分辨率得到了很大程度的提高. 其中水的吸收峰较为简单，有3个谱峰，分别位于7109，6978 和6839 cm−1处，可分别归属为游离、弱氢键键合和强氢键键合的OH 基团［8，35］. 而DMSO的谱峰较为复杂，有6个吸收峰，分别位于7120，7000，6908，6846，6731和6510 cm−1处，前5个谱峰来源于CH 基团伸缩振动和弯曲振动的组合频［36］，第6 个峰可归属为S=O 基团的伸缩振动倍频峰［3］.

2.2 DMSO与水的相互作用

图3 为不同DMSO-水混合物光谱的近似四阶导数近红外光谱图. 与图2 进行比较可见，随着DMSO含量的增加，水的3个吸收峰强度迅速减小，其中弱氢键键合的―OH峰甚至完全被掩盖. 一方面―OH峰的强度随混合物中水含量的减少而降低，另一方面DMSO 与水之间的相互作用破坏了水分子的氢键网络，使水的结构发生了变化. DMSO 与水的相互作用强于水分子之间的相互作用［37］，因此在DMSO-水混合物中，水主要以与DMSO形成氢键的形式存在. 从图3还可见，7000和6731 cm−1处C―H 峰的强度随着DMSO 含量的增加而增大，但在7120，6908 和6846 cm−1处的C―H 峰的强度随着DMSO含量的增加反而逐渐降低，这是因为它们与O―H吸收峰重叠严重，导致谱峰表现出随水含量减少而减小的规律. 此外，随着DMSO含量的增加，C―H的5个吸收峰均向低波数移动，这可能由水与S=O间的氢键作用对邻位CH基团造成的影响，或者由水与CH基团之间的弱相互作用所致［38］. 另外，水峰的重叠也有可能导致谱峰的移动.

Fig.3 NIR transformed spectra of xDMSO⁃water mixture

Fig.4 Variation of the peak intensity at 6442 cm−1 of xDMSO⁃water

由图3 还可见，6510 cm−1处吸收峰的强度随着DMSO 含量的增加而增加，进一步说明此峰归属为S=O的合理性. 更有趣的是，在6442 cm−1处出现了一个新的谱峰，该峰显然是由DMSO与水相互作用而产生的，根据谱峰的位置和DMSO的性质，该峰应归属为DMSO与水形成氢键的S=O结构. 为了对该峰进行详细分析，图4 给出了该峰峰强度随DMSO 含量的变化. 可见，随着DMSO 摩尔分数的增加，峰强度快速增加，30%时增速放缓，60%时峰强度达到最大，随后峰强度迅速降低. 2个明显的拐点分别位于30%和60%，此时DMSO与水的摩尔比分别接近1∶2和2∶1. 据此可以推测，在DMSO与水的混合物中可能存在摩尔比分别为1∶2和2∶1的氢键结构，分别表示为DW2和D2W. 当DMSO含量少于水含量时，DMSO 上的S=O 先与2 个水分子形成DW2 结构且随着DMSO 含量的增加而增多，当DMSO 含量明显多于水含量时，水分子与2个DMSO 形成D2W结构且随着水含量的减少而减少，即在30%和60%混合物中DMSO与水存在的主要形式分别为DW2和D2W结构. 需要注意的是，当DMSO和水的含量相近时并没有出现明显的拐点，可能是由于摩尔比为1∶1的氢键结构（DW）稳定性较弱，也可能是摩尔比分别为1∶2和1∶1的2种结构在光谱上的相似性致使两者之间的转换不存在明显的拐点.

为了进一步验证上述结论，测定了不同DMSO-水混合物在20 ℃时的拉曼光谱. 图5（A）为不同DMSO-水混合物在1100～980 cm−1波长范围的拉曼光谱，该谱峰源于S=O 的伸缩振动［39］. 随着DMSO含量的增加，峰值向高波数方向移动，表明S=O与水之间确实存在相互作用. 但由于谱峰的重叠，难以得到更多的有效信息. 因此，同样采用CWT 技术提高光谱的分辨率，结果见图5（B）. 在1059，1041，1026和1012 cm−1处出现了4个峰，其中1059 cm−1处的峰可归属为游离的S=O结构［40］. 为了对其余3 个峰进行归属，测定了不同含量DMSO-CCl4混合物的拉曼光谱［图5（C）］. 近似导数光谱见图5（D）. 由图5（D）可见，位于1059 和1041 cm−1处的谱峰，分别对应于游离和自聚状态时S=O［40，41］.对比图5（B）和（D），1026和1012 cm−1处出现了2个明显的谱峰，并且二者的最高值分别对应DMSO摩尔分数60%和30%. 此结果进一步表明D2W 和DW2 的存在，与上述近红外光谱的结果高度一致. 值得注意的是，D2W和DW 结构中S=O的氢键结构非常相似，通过1026 cm−1处的谱峰无法确认属于哪种结构，但其最高强度对应DMSO摩尔分数为60%，可以说明摩尔比1∶1的DW结构稳定性可能很差甚至并不存在.

Fig.5 Raman spectra(A, C) and transformed spectra(B, D) of xDMSO⁃water(A, B) and xDMSO⁃CCl4(C,D)mixtures(C)at 20 ℃

2.3 低温DMSO-水混合物中水的结构

为了对低温水结构进行分析，采用温控近红外光谱技术测定了温度范围分别为20～0 ℃和20～−70 ℃条件下的水和30%DMSO-水混合物的近红外光谱. 其中−70 ℃为文献［42］报道的DMSO-水混合物的凝固点，但在本文中，−70 ℃时的光谱仍为液态混合物的光谱，未对凝固后的光谱进行测量.图6（A）和（B）分别是由CWT计算得到的近似四阶导数光谱. 从图6（A）可见，纯水在温度>5 ℃时光谱中主要有代表游离、弱氢键键合和强氢键键合的OH基团的3个峰. 随着温度的降低，它们的强度分别表现出减小、增加和小幅度变动. 温度越低，水的氢键作用越强，更多游离的OH基团转化为氢键键合结构［8］. 在0 ℃时，水的光谱发生了很大变化，3个OH基团峰消失，在6754 cm−1处出现了一个新峰且为光谱中的主要谱峰，此峰可归属为水的四面体结构［43，44］. 由此可以看出，冰中水的结构主要是四面体结构.

Fig.6 Transformed spectra of water(A)and 30%DMSO⁃water mixture(B)at different temperatures

图6（B）为不同温度时DMSO-水混合物的近红外光谱，与图6（A）中的结果完全不同. 前述的谱峰归属和分析表明，混合物中主要是通过氢键形成的DMSO-水聚集体，即DW2结构. 有趣的是，图6（B）中的光谱从20 ℃到−70 ℃都没有发生明显的变化，只是各谱峰的相对强度随温度的降低发生了变动.由于谱峰的重叠，难以对谱峰的强度变化进行细致分析，但仍能看出强氢键键合的OH 峰（6839 cm−1）随温度的降低逐渐增加. 特别值得注意的是，6510 cm−1处S=O 峰的强度随温度的降低逐渐减弱，而6442 cm−1处的谱峰（氢键键合的S=O，在此处主要是DW2结构）强度逐渐增加，说明随着温度的降低形成了更多的DW2结构. 因此，DW2结构是混合物冰点降低的主要原因，即DW2结构抑制了四面体水结构的形成.

2.4 分子动力学模拟分析

Fig.7 Structure and statistic of S=O structures from the trajectory of molecular dynamics simulation

为了进一步对上述结论进行验证，分别对30%DMSO-水混合物在20 ℃和−70 ℃时的轨迹进行了模拟，并采用上述氢键的判断标准统计了轨迹中游离S=O 基团、D2W 和DW2 结构的出现概率. 图7 是3种结构及其统计结果. 可以看出，混合物中的DMSO和水分子主要以DW2结构的形式存在，并且低温时DW2的含量有所增加，与实验结果高度一致，有力支持了DW2结构抑制四面体水结构的形成导致混合物冰点降低的结论.

3 结 论

采用近红外光谱结合拉曼光谱和分子动力学模拟等技术对DMSO-水混合物中的水结构进行了研究. 利用CWT 技术可以提高光谱的分辨率，从高分辨的光谱中可以明显看出DMSO 与水形成氢键的S=O 峰，根据此峰的强度随DMSO 的含量变化得到了DMSO-水混合物中S=O 与水形成的2 种结构（D2W和DW2）. 拉曼光谱进一步验证了2种结构的存在. 通过对不同温度下水和30%DMSO-水混合物的近红外光谱分析，发现DW2结构抑制了低温时四面体水结构的形成可能是DMSO-水混合物冰点降低的原因，此结论得到了分子动力学模拟的验证. 近红外光谱为低温下水结构的研究提供了良好手段，可广泛用于低温体系中水的结构和氢键作用的研究.