结直肠癌组织中miR-92b-3p、FBXW7的表达变化及临床意义

张文天，刘杰，杜锦波

沧州市人民医院，河北沧州 061000

结直肠癌是源自肠道上皮的恶性肿瘤，其发病率和病死率在恶性肿瘤中分别居第三位和第四位，对人类生命安全造成巨大危害[1]。结直肠癌起病隐匿，初期常无特异症状且易转移，多数患者确诊时癌症已经处于进展期，手术效果较差，病死率和复发率均较高[2]。因此，进一步探寻结直肠癌的病变机制及关键靶点对研发靶向药物和早期筛查至关重要。微小RNA(miRNA)是一类在真核生物中常见的非编码RNA，其与3′非翻译区结合后能够调控转录及翻译过程，参与细胞增殖和凋亡等[3]。miR-92b-3p属于miR-25家族，参与合成mRNA-蛋白复合物，在细胞周期中调控G1/S期，进而促进肿瘤细胞增殖[4]。相关研究[5]表明，miR-92b-3p在多种癌组织中表达上调，通过介导PI3K/Akt通路促进癌细胞侵袭及转移。FBXW7是一种抑癌基因，位于4号染色体q31，其表达缺失或功能紊乱可以导致染色体不稳及肿瘤发生率提高[6]。FBXW7主要受蛋白激酶C调控，通过靶向泛素化使多种转录激活因子及其癌蛋白失活，在肿瘤转移、辅助诊断以及耐药性等方面具有重要作用[7]。但miR-92b-3p和FBXW7在结直肠癌中的研究较少。因此，本研究观察了结直肠癌组织中miR-92b-3p和FBXW7的表达情况，并探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年4月～2019年5月我院收治的153例结直肠癌患者。纳入标准：所有患者诊断符合《世界卫生组织肿瘤分类诊断系统》[8]中的标准且经术后病理确诊为结直肠腺癌；均首次诊断为结直肠癌，且既往未接受过肠道手术或放化疗；患者基本信息及病理资料完整，且同意配合本次试验。排除标准：合并肛周瘘口、结肠穿孔、克罗恩病以及肠道结核等严重肠道疾病者；伴有其他原发恶性肿瘤(如胶质瘤、胃癌以及乳腺癌等)者；肝肾功能失代偿者；伴有先天遗传缺陷者。其中男83例、女70例，年龄(56.29±8.51)岁；高分化89例、中分化51例、低分化13例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移128例；临床分期Ⅰ期63例、Ⅱ期60例、Ⅲ期21例、Ⅳ期9例；肿瘤直径≤5 cm者81例，>5 cm者72例；有远处转移19例，无远处转移134例。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 结直肠癌组织中miR-92b-3p、FBXW7表达检测 采用实时荧光定量PCR技术。术中分别采集癌组织及其癌旁5 cm处正常结肠组织，先在液氮中暂存，术后统一置于-80 ℃冰箱中。以上组织各取50 mg，先于冰上研磨，然后各加入1 mL TRIzol试剂(Invitrogen公司，批号:20170326)，依照操作规范提取总RNA。采用RT Enzyme Mix(Abcam公司，批号:20170322)将提取的10 μg总RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green Mix试剂盒(Thermo公司，批号20170329)定量检测miR-92b-3p和FBXW7。反转录时miR-92b-3p和FBXW7的反应条件均为42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。miR-92b-3p的正向引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTCGTCCCGGC-3′、反向引物序列为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCC-3′;内参基因U6的正向引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FBXW7正向引物序列为5′-CGAACTCCAGTAGTATTGTGGACCT-3′、反向引物序列为5′-TTCTTTTCATTTTTGTTGTTTTTGTATAGA-3′;内参基因GAPDH正向引物序列为5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTCGC-3′、反向引物序列为5′-TCCCGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。以上引物序列均由上海生工生物公司合成。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反应体系为SYBR Green Mix 10 μL、正反向引物均为1 μL、dH2O 8 μL、cDNA template 1 μL，共计20 μL。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反应条件均为预变性95 ℃ 2 min、变性94 ℃ 20 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，共计40个循环，每个样本均测量3次。以2-ΔΔCt法计算miR-92b-3p和FBXW7的相对表达量。

2 结果

2.1 结直肠癌组织及其癌旁正常组织中miR-92b-3p、FBXW7表达比较 结直肠癌组织及其癌旁正常组织中miR-92b-3p的相对表达量分别为7.82±1.53、1.69±0.71，而FBXW7的相对表达量分别为0.36±0.13、0.98±0.42。结直肠癌组织中miR-92b-3p相对表达量较癌旁正常组织高，FBXW7的相对表达量较癌旁正常组织低(t=44.954、17.443，P均<0.01)。

2.2 miR-92b-3p、FBXW7表达与结直肠癌临床病理参数的关系 见表1。

表1 miR-92b-3p、FBXW7表达与结直肠癌临床病理参数的关系

2.3 结直肠癌组织中miR-92b-3p和FBXW7表达的相关性 结直肠癌组织中miR-92b-3p和FBXW7的表达呈负相关(r=-0.751，P=0.000)。

3 讨论

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其年均新增病例约140万，且病死率在癌症中位居第四位，对人类健康造成巨大危害[9]。基因易感性、家族遗传、饮食习惯以及地域差异均能够影响结直肠癌的发生。手术联合化疗是目前治疗结直肠癌的常见手段，但由于早期诊断困难、癌症易转移和复发，因此疗效较差。据相关研究[10]报道，早期诊断的结直肠癌患者5年存活率约为90%，然而，癌胚抗原(CEA)及糖类抗原(CA19-9)等肿瘤标志物的敏感度和特异性均较低，因此深入发掘结直肠癌病变机制及找寻关键靶点对早期诊断和延长患者生存时间意义重大。随着表观遗传学和分子生物学的不断发展，非编码RNA、DNA甲基化、DNA磷酸化以及组蛋白修饰等过程均被证明能够使信号传导通路异常，使原癌基因和抑癌基因功能紊乱，在肿瘤发生及进展中起重要作用[11,12]。

miRNA是由18～25个核苷酸组成的短链小RNA，其不能编码蛋白质且具有高度保守性，但能够结合3′端的非编码区对细胞分化、增殖及迁移等过程起到调控作用。miRNA的调控网络比较复杂，其序列突变、表达异常以及甲基化均会导致miRNA功能失调，进而使细胞增殖、分化及凋亡等过程发生紊乱，增加正常细胞演变为肿瘤细胞的概率[13]。miR-92b属于miR-25家族，由miR-92b-3p和miR-92b-5p两条miRNA分子组成，其中miR-92b-3p能够进入mRISC中进而促进miRNA成熟[14]。既往研究[15]表明，miR-92b-3p能够通过抑制其靶基因p57，从而导致许多抑癌基因甲基化，使癌细胞异常增殖。本研究结果表明，结直肠癌组织中miR-92b-3p的相对表达量较癌旁正常组织高，其原因可能为癌组织中的原癌基因c-myc表达上调，通过结合miR-92b-3p启动子区域的E-box位点诱导miR-92b-3p表达，使miR-92b-3p表达提高[16]。本研究结果表明，结直肠癌组织中miR-92b-3p的表达与临床分期、淋巴结转移及分化程度有关，且恶性度越高，其表达量越高。其机制可能为miR-92b-3p通过抑制抑癌基因NLK和DKK3，进而调节Wnt/Beta-catenin信号通路，增强癌细胞的增殖及侵袭能力[17]。当抑制miR-92b-3p时，癌细胞的细胞周期受阻，癌细胞的克隆和增殖能力减弱[17]，表明miR-92b-3p对癌症的分化、侵袭和转移起促进作用。

FBXW7属于F-box蛋白家族，由F-box结构域、D结构域以及WD40重复序列组成，可以通过连接SKP1并结合SCF复合物，使多种靶蛋白泛素化及降解。既往研究[18]表明，c-myc、Notch、细胞周期蛋白E(cyclin E)以及Presenilin等基因均是SCF FBXW7 E3连接酶的底物，通过调控其表达使FBXW7在细胞分裂、分化及维持细胞干性等途径中起关键作用，降低细胞癌变的风险。本研究结果表明，结直肠癌组织中FBXW7的相对表达量较癌旁正常组织低，其原因可能为癌细胞的基因缺失、基因突变以及启动子甲基化相互作用，共同导致癌组织中的FBXW7表达下调[19]。本研究结果表明，FBXW7的表达与临床分期、淋巴结转移及分化程度有关，且恶性度越高，其表达越低，表明FBXW7能够抑制恶性肿瘤进展，且可能作为判断病情程度的依据。其原因可能为FBXW7的外显子能够直接结合p53，使蛋白酶通过泛素化靶向降解多种原癌基因产物，抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡，最终阻断或延缓癌细胞侵袭或转移[18]。此外，FBXW7还可以抑制cyclin E，维持染色体相对稳定，避免染色体损伤或发生基因突变，而在癌组织中，FBXW7表达下降，对cyclin E的负性调控能力减弱，进而使癌细胞易于分化及侵袭[20]。

本研究结果显示，癌组织中的miR-92b-3p和FBXW7表达呈负相关，表明miR-92b-3p可能靶向调控FBXW7，使其表达下调从而促进肿瘤形成和进展。其机制可能为miR-92b能够结合FBXW7的3′非编码区，进而抑制其表达，加速癌细胞侵袭。c-myc与FBXW7呈负反馈调节，而c-myc则可以诱导miR-92b-3p表达，间接表明miR-92b-3p与FBXW7呈负相关[21]。

综上所述，结直肠癌组织中miR-92b-3p表达增加，而FBXW7表达降低，二者均与临床分期、淋巴结转移以及分化程度有关，未来可能作为临床评估患者病情进展程度及药物治疗的靶点。