BALB/c裸鼠血管瘤模型的建立及普萘洛尔对其瘤体的抑制作用

安雯婷，郭丽娜，房克峰,姜乐，徐珊，高志嵩，徐伟立

河北医科大学第二医院，石家庄 050051

血管瘤是婴幼儿时期最常见的良性肿瘤，尽管其中某些类型如毛细血管瘤存在缓慢消退的可能，但仍有10%～20%的血管瘤患者存在遗留的外观损害、破溃、功能障碍等并发症，严重的甚至威胁到生命[1,2]，因此早期治疗十分必要。现有治疗血管瘤的方法很多，包括手术，激光照射，局部或系统使用皮质类激素、β-肾上腺素受体阻断剂、干扰素、长春新碱等治疗方式[3]。普萘洛尔作为最常见的一种β-肾上腺素受体阻断剂，目前已成为婴幼儿血管瘤治疗的一线药物[4]。现有的针对普萘洛尔治疗血管瘤的研究大多是基于体外细胞模型，对于动物模型及其给药方式和量效关系的探讨相对较少。因此，2015年1月～2018年12月本研究拟通过建立血管瘤BALB/c裸鼠动物模型，探讨普萘洛尔治疗动物模型血管瘤的合理给药剂量和最佳方案，从而为普萘洛尔治疗血管瘤的机制研究提供重要的理论和实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器 3～5周龄雌性BALB/c裸鼠40只，体质量15～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有裸鼠均在隔离器屏障环境内(SPF级)饲养，饲养水及垫料均经15磅高压消毒30 min，饲料经紫外线照射30 min。不同浓度(0.01%、0.05%、0.1%)的普萘洛尔溶液(美国sigma公司)；电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；游标卡尺(上海精密仪器仪表有限公司)；全自动高压灭菌器(日本三菱集团)。

1.2 BALB/c裸鼠血管瘤模型的建立 供体增殖期血管瘤来源于河北医科大学第二医院小儿外科住院手术治疗的血管瘤患儿(已通过医院伦理委员会审查，且获得家长知情同意，并对患者的个人信息进行保密)。无菌条件下手术切除患儿血管瘤组织，部分瘤体组织甲醛固定后送病理学检查并证实为增殖期婴幼儿型毛细血管瘤。用生理盐水处理剩余瘤体组织，剔除瘤体皮下纤维结缔组织和脂肪组织，切割成大小为2 mm×2 mm×2 mm的组织块若干，经皮肤切口移植于40只裸鼠腰背部皮下组织内，每只2处。移植在超净工作台内无菌环境下进行，并在标本离体1 h内完成所有移植工作。瘤体植入后定期观察并测量记录瘤体生长情况，成瘤标准为皮下结节直径大于0.5 cm。

1.3 模型动物分组及处理 瘤体移植后第45天将40只荷瘤小鼠随机分为5组(每组8只)：治疗组1，腹腔注射0.01%普萘洛尔溶液0.4 mL，1次/d，持续1周；治疗组2，腹腔注射0.05%普萘洛尔溶液0.4 mL，1次/d，持续1周；治疗组3，腹腔注射0.1%普萘洛尔溶液0.4 mL，1次/d，持续1周；治疗组4，经口灌胃0.01%普萘洛尔溶液0.4 mL，1次/d，持续1周；对照组，腹腔注射蒸馏水0.4 mL，1次/d，持续1周。

2 结果

2.1 各组瘤体体积比较 见表1、2。

表1 腹腔注射不同浓度普萘洛尔对裸鼠瘤体体积的影响

表2 普萘洛尔不同给药方式对裸鼠瘤体体积的影响

2.2 各组肿瘤组织HE染色情况比较 组织形态学上，对照组内皮细胞富集、纤维组织少，内皮细胞增殖并聚集成团，间隔组织少，界限清晰，细胞呈条索状或团块状排列，形态大小各异，胞核肥大而淡染，呈现增殖的特点。治疗组血管瘤的组织结构稀疏，血管内皮细胞明显减少且分散凌乱，细胞溶解，破碎，局部变性坏死，管腔间有脂肪细胞、纤维细胞增生，细胞核小而染色浅。且普萘洛尔的给药浓度越高，对内皮细胞增殖抑制作用越明显，见图1。

2.3 各组体质量比较 干预后第7、14、21天，治疗组1、2、3及对照组两两相比，治疗组1与治疗组4相比，裸鼠体质量比较差异无统计学意义，见表3、4。

3 讨论

婴幼儿血管瘤是由于血管内皮细胞异常增生，发生在皮肤和软组织的一种良性肿瘤。血管瘤通常在婴儿出生后1周左右出现；前6个月为快递增殖期，瘤体增长迅速，形成草莓样斑块或肿瘤；6个月后进入晚期增殖期，增长逐渐放缓；1岁后进入消退期并最终缓慢消退，7岁时消退率可达70%[5,6]。尽管血管瘤是一种自限性疾病，但根据其风险等级，部分血管瘤仍需要进行治疗，以抑制血管内皮组织增生和促进瘤体消退[7]。《血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南》(2016)指出，高风险血管瘤一线治疗药物为口服普萘洛尔，中风险者可局部外用β-肾上腺素受体阻断剂，低风险者可随访观察[8]。普萘洛尔自2008年首次被报道用于婴幼儿血管瘤治疗，如今成为一线治疗药物，但其具体治疗机制仍未完全>阐明[9]。文献报道有影响内皮细胞因子、成血管因子、生长因子等细胞因子学说，有调节细胞外基质和蛋白酶促进瘤体消退学说，也有促进细胞凋亡学说等[10,11]。截至目前，针对普萘洛尔治疗血管瘤的研究大多是利用体外内皮细胞，而利用血管瘤移植动物模型的研究相对较少。

图1 各组肿瘤组织HE染色(×200)

由于普萘洛尔用于婴幼儿血管瘤的治疗主要基于临床的意外发现，通过动物模型研究量效关系和作用机制较少。本研究通过建立婴幼儿血管瘤裸鼠移植模型来探讨普萘洛尔的合理给药剂量和给药方式，采用不同剂量和不同给药途径普萘洛尔对模型裸鼠进行干预，在不同时期观察裸鼠移植瘤体体积。结果表明，对照组瘤体体积在干预后14天内表现为逐渐增大，第21天时出现缩小，可能与血管瘤存在自身消退的特点有关。同时研究发现，干预后第7、14、21天，治疗组1、2、3较对照组瘤体体积小，表明了普萘洛尔对瘤体增殖的抑制作用。干预后第14、21天，治疗组3较治疗组1、2瘤体体积小，表明随着治疗组普萘洛尔给药剂量的增加，裸鼠瘤体具有更明显的消退趋势，普萘洛尔对裸鼠血管瘤的生长抑制作用具有一定的剂量依赖性。从给药方式对瘤体消退效果影响来看，干预后第7天，治疗组1较治疗组4瘤体体积小，但差异并无统计学意义；干预后第14、21天，治疗组1较治疗组4瘤体体积明显减小。这可能与腹腔注射只存在肝脏首过代谢，而灌胃存在胃肠和肝脏首过代谢有关，腹腔注射的生物利用度较灌胃高，疗效显著，瘤体体积更小。现有的血管瘤裸鼠模型研究中，普萘洛尔多采用口服灌胃方式，本研究显示普萘洛尔口服灌胃方式治疗效果略差。本研究采用腹腔注射普萘洛尔的方法显示了较好的治疗效果，提供了一种新的给药治疗途径。各组病理学对比发现，治疗组瘤体固缩，毛细血管分布较少，瘤体较治疗前显著缩小，对照组瘤体血供良好，可见少量小血管进入瘤体。结合HE染色结果以及瘤体测量结果，说明普萘洛尔对裸鼠模型血管瘤具有明显抑制作用。本实验进一步通过对荷瘤小鼠生长情况进行对比来评估给药毒性。结果显示，与对照组相比，治疗组裸鼠没有显示出体质量差异，说明4个普萘洛尔治疗组均在安全剂量范围内，毒副作用较轻，耐受性良好，对裸鼠机体无明显损害。

表3 腹腔注射不同浓度普萘洛尔对裸鼠体质量的影响

表4 普萘洛尔不同给药方式对裸鼠体质量的影响

本研究成功建立了BALB/c裸鼠血管瘤模型，普萘洛尔可抑制模型裸鼠瘤体生长，对裸鼠机体无明显损害，且腹腔注射较灌胃效果显著。在此基础上，后续研究将进一步探讨普萘洛尔抗血管瘤作用的相关靶点和机制，以更好地指导其在血管瘤治疗中的应用。